DSpace Colección :http://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/74112024-03-29T06:44:43Z2024-03-29T06:44:43ZEstudio de la Función de Gαi2 sobre la Polaridad Celular y Dinámica de los Microtúbulos Durante la Migración Colectiva en Células de la Cresta Neural Craneal de Xenopus.Villaseca Herrera, Soraya Constanzahttp://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/106262023-11-10T22:51:15Z2023-01-01T00:00:00ZTítulo : Estudio de la Función de Gαi2 sobre la Polaridad Celular y Dinámica de los Microtúbulos Durante la Migración Colectiva en Células de la Cresta Neural Craneal de Xenopus.
Autor : Villaseca Herrera, Soraya Constanza
Editor : Torrejón Quezada, Marcela Eliana, profesor guía
Resumen : La dinámica de los microtúbulos es esencial para la mantención de la polaridad celular durante la migración, ya que intervienen en el tráfico y destino de las proteínas requeridas para establecer una correcta polaridad antero-posterior. Sin embargo, cambios en la estabilidad de los microtúbulos podrían contribuir a la pérdida de esta polaridad, a la disrupción del desensamblaje de las adhesiones focales, a un cambio severo en el nivel de polimerización del citoesqueleto de actina, en resumen, afectar la migración celular colectiva. Análisis previos en nuestro laboratorio muestran que la proteína G heterotrimérica, específicamente Gαi2, regula la migración de las células de la Cresta Neural Craneal (CNC), ya que la pérdida de función de Gαi2 se traduce en la inhibición de la migración de estas células y deslocalización de proteínas de polaridad celular como Par3 y ζPKC, resultados que se apoyan con estudios de otros investigadores en células del
sistema inmune, donde también la ausencia de Gαi2 inhibe la migración de los linfocitos T y macrófagos hacia los sitios de inflamación. Adicionalmente, también se ha reportado en C. elegans que Gαi controla la polaridad celular durante la división asimétrica, a través de la regulación de las fuerzas de los microtúbulos para orientar correctamente el huso mitótico. Por lo tanto, con el fin de indagar en el mecanismo funcional de la subunidad Gαi2 durante la migración celular, y con ello su posible contribución a regular los microtúbulos y la polaridad celular, en esta tesis se investigó el papel de la subunidad Gαi2 de la proteína G heterotrimérica en la
CNC, una población embrionaria que migra extensivamente y colectivamente a lo largo del embrión con el fin de formar otros tejidos. Nuestros resultados muestran que Gαi2 se localiza en toda la célula, pero en la corteza celular se localiza cercana a la red de microtúbulos, posiblemente controlando la dinámica de éstos. La disminución de la expresión de Gαi2 a través de un morfolino específico, redujo fuertemente la despolimerización de los microtúbulos aumentando su estabilidad, afectando la polimerización del citoesqueleto de actina a través del aumento del tamaño de las protrusiones y el área de las adhesiones focales en el tiempo. También observamos un aumento en la actividad de Rac1 en el borde libre y en el contacto célula-célula, cambiando la localización de RhoA hacia el borde director, lo que en conclusión afecta la migración de la CNC. Este efecto pudo ser rescatado con bajas concentraciones de nocodazol como droga despolimerizante de los microtúbulos, y sólo parcialmente por inhibición de Rac1. Además, encontramos que Gαi2 interacciona con EB1, EB3, tubulina, α5-integrina y ζPKC, como se muestra por co-immunoprecipitación, lo que apoya el papel crítico de Gαi2 en la dinámica de los microtúbulos, el desensamblaje de las adhesiones focales y la polaridad celular.
Por lo tanto, nuestros resultados nos permiten proponer a Gαi2 como un regulador maestro de la polaridad, morfología y dinámica de la adhesión célula-matriz, a través del control de la dinámica de los microtúbulos, y con ello, de la conversación cruzada entre los citoesqueletos de actina y tubulina, permitiendo de esta forma la correcta migración colectiva de las células de la CNC.; The microtubule dynamics is essential for the maintenance of cell polarity during migration. They are involved in the trafficking and destination of the required proteins to establish a correct antero-posterior polarity. Neverthless, changes in the stability of microtubules could contribute to the loss of this polarity, the disruption of the focal adhesion disassembly, severe changes in actin polymerization level, in summary to affect collective cell migration. Previous analyzes in our laboratory have shown that the heterotrimeric G protein, specifically Gαi2, regulates the Cranial Neural Crest (CNC) cells migration. The loss of function of Gαi2 inhibits the migration of these cells and promote the misslocalization of polarity proteins such as Par3 and ζPKC, results supported by other studies in immune system where the loss of function of Gαi2 also inhibits the migration of macrophages and T lymphocytes towards the inflammation sites. Addicionally, studies in C. elegans have described that Gαi2 control de microtubules pulling forces to orientate the spindle correctly during asymmetric cell division. Therefore, in order to investigate the functional mechanism of the Gαi2 subunit during cell migration, and its possible contribution to regulating microtubules dynamics and cell polarity, in this thesis we investigated the role of the Gαi2 subunit of the heterotrimeric G protein in the CNC cells, an embryonic population that extensively and collectively migrates throughout the embryo, in order to generate other tissues. Our results have shown that Gαi2 is localized throughout the cell, but in the cell cortex it is localized close to the microtubules network, possibly controlling microtubules dynamics. The Gαi2 expression was reduced through a specific morpholino, that strongly reduced the depolymerization of the microtubules, increasing their stability, affecting the actin polymerization increasing the protrusions size and the focal adhesions area. Also, Gαi2 loss of function resulted in an increase of the Rac1 activity in the free edge and in the cell-cell contact, a changing in the location of RhoA towards the leading edge, which in conclusion affect CNC migration. These effects were restored by low concentrations of nocodazole treatment, as microtubule depolymerizing drug, but partially rescued by Rac1 inhibition. In addition, we found that Gαi2 interacts with EB1, EB3, tubulin, α5-integrin and ζPKC, as shown by co-immunoprecipitation, supporting a critical role for Gαi2 in microtubule dynamics, focal adhesions disassembly and cell polarity. Therefore, our results together, allow us to propose to Gαi2 as a master regulator of, cell polarity, morphology and cell-matrix adhesion dynamics, through the control of microtubule dynamics, contributing to the crosstalk between both cytoskeletons (actin and tubulin), thus allowing the correct collective migration of CNC cells.
Descripción : Tesis para optar al grado de Doctor en Ciencias Biológicas área Biología Celular y Molecular.2023-01-01T00:00:00ZCaracterización del receptor de acetilcolina nicotínico (nAChR) en la sinapsis neuromuscular de la especie Branchiostoma lanceolatumMartínez Campos, María Esperanzahttp://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/106032023-11-10T23:16:40Z2023-01-01T00:00:00ZTítulo : Caracterización del receptor de acetilcolina nicotínico (nAChR) en la sinapsis neuromuscular de la especie Branchiostoma lanceolatum
Autor : Martínez Campos, María Esperanza
Editor : Henríquez Hohmann, Juan Pablo, profesor guía
Resumen : La unión neuromuscular (UNM) es la sinapsis periférica entre neuronas motoras y fibras musculares que controla el movimiento coordinado de una gran variedad de organismos. El estudio de la UNM se ha realizado en distintos modelos animales. En dicho contexto, una alternativa concreta para adquirir conocimiento sobre los requerimientos celulares y moleculares básicos de las sinapsis es conocer los procesos evolutivos que han dado lugar a los primeros contactos neuromusculares. Los cordados se dividen en el subfilo de los urocordados, cefalocordados y vertebrados. Los cefalocordados o anfioxos (en el caso de esta tesis, la especie Branchiostoma lanceolatum) son particularmente interesantes, pues poseen una anatomía que comparte estructuras similares con los vertebrados. Entre ellas destacan la presencia de un tubo neural, una notocorda (presente en etapa embrionaria y adulta) y miotomas (músculos esqueléticos del tronco). Diversos estudios estructurales han determinado que el tubo neural
establece contactos con la región dorsal de la notocorda mediante estructuras llamadas astas notocordales, las cuales emergen de placas musculares transversales que la notocorda posee en su interior. Además, se han observado procesos citoplasmáticos que emergen desde las láminas musculares de los miotomas y que establecen contacto con las regiones ventrolaterales del tubo
neural. En cuanto a la identidad de dichos contactos sinápticos, se desconoce la naturaleza de los receptores que cumplen esta función en los anfioxos. Al respecto, diferentes experimentos de hibridación in situ y detección enzimática de acetilcolinesterasa han identificado componentes colinérgicos en la interacción del tubo neural con la notocorda y con los procesos citoplasmáticos
de los miotomas, lo que sugiere la presencia de sinapsis colinérgicas en la UNM de los anfioxos. Aun cuando en la UNM de vertebrados la despolarización de las fibras musculares y la consecuente contracción muscular dependen del receptor de acetilcolina nicotínico (nAChR), en el anfioxo no se ha identificado la presencia ni identidad de los receptores presentes en estas sinapsis neuromusculares. En base a estos antecedentes, se propone como hipótesis que “En la especie Branchiostoma lanceolatum, se encuentran nAChR en las interacciones neuromusculares que establece el tubo neural tanto con proyecciones de los miotomas como con la región dorsal de la notocorda”. Nuestros estudios de histología y detección de sondas y anticuerpos específicos en cortes de anfioxos adultos muestran una distribución de nAChRs en regiones delineadas alrededor y dentro de la porción ventral del tubo neural. Sorprendentemente, estas regiones
muestran una distribución segmentada en el eje antero-posterior del tubo neural.
Nuestros estudios in silico arrojaron la presencia de genes ortólogos para las subunidades α1, α3, α5-11 y β2-4 del nAChR, lo que sugiere que la conformación neuromuscular del receptor es diferente a la de los vertebrados. Estos hallazgos en B. lanceolatum amplían nuestros conocimientos sobre los requisitos celulares y moleculares básicos de las sinapsis que dieron lugar a los primeros contactos neuromusculares mediante el análisis comparativo entre vertebrados e invertebrados.; The neuromuscular junction (NMJ) is the peripheral synapse between motor neurons and muscle fibers that controls coordinated movement in a wide variety of organisms. The study of the NMJ has been performed in different animal models. In this context, a concrete alternative to gain knowledge about the basic cellular and molecular requirements of synapses is to learn about the evolutionary processes that led to the first neuromuscular contacts. Chordates are divided into the subphylum of urochordates, cephalochordates and vertebrates. Cephalochordates or amphioxus (in the case of this thesis, the species Branchiostoma lanceolatum) are particularly interesting, as they have an anatomy that shares similar structures with vertebrates. These include the presence of a neural tube, a notochord (present in embryonic and adult stages) and myotomes (skeletal muscles of the trunk). Several structural studies have determined that the neural tube establishes contacts with the dorsal region of the notochord through structures called notochordal horns, which emerge from transverse muscular plates that the notochord has in its interior. In addition, cytoplasmic processes have been observed that emerge from the muscular laminae of the myotomes and establish contact with the ventrolateral regions of the neural tube. As for the identity of these synaptic contacts, the nature of the receptors that perform this function in amphioxus is unknown. In this regard, different in situ hybridization experiments and enzymatic detection of acetylcholinesterase have identified cholinergic components in the interaction of the neural tube with the notochord and with the cytoplasmic processes of the myotomes, suggesting the presence of cholinergic synapses in the UNM of amphioxus. Even though in the vertebrate UNM the depolarization of muscle fibers and the consequent muscle
contraction depend on the nicotinic acetylcholine receptor (nAChR), in amphioxus the presence and identity of the receptors present in these neuromuscular synapses have not been identified. Based on this background, it is hypothesized that "In Branchiostoma lanceolatum species, nAChRs are found in the neuromuscular interactions established by the neural tube with both myotome
projections and the dorsal region of the notochord". Our histology studies and detection of specific probes and antibodies in adult amphioxus slices show a distribution of nAChRs in delineated regions around and within the ventral portion of the neural tube. Surprisingly, these regions show a segmented distribution along the antero-posterior axis of the neural tube. Our in silico studies yielded the presence of orthologous genes for the α1, α3, α5-11 and β2-4 subunits of the nAChR, suggesting that the neuromuscular conformation of the receptor is different from that of vertebrates. These findings in B. lanceolatum extend our knowledge of the basic cellular and molecular requirements of the synapses that gave rise to the first neuromuscular contacts through comparative analysis between vertebrates and invertebrates.
Descripción : Tesis para optar al grado académico de Magíster en Neurobiología.2023-01-01T00:00:00ZDesarrollo de un candidato vacunal contra la tuberculosis.Rivas Solari, Evaldo Martinohttp://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/101692023-11-11T00:13:02Z2022-01-01T00:00:00ZTítulo : Desarrollo de un candidato vacunal contra la tuberculosis.
Autor : Rivas Solari, Evaldo Martino
Resumen : Mycobacterium tuberculosis (Mtb) es un patógeno del sistema respiratorio que
infecta los pulmones, provocando tuberculosis (TB). La única vacuna aprobada para su
uso en humanos, el Bacilo de Calmette y Guérin, ha resultado ineficaz eliminando al
patógeno de circulación, mientras que su capacidad protectora varía significativamente
según las poblaciones y edades. Mtb ha desarrollado capacidades de sobrevivencia y
evasión al sistema inmune. Su éxito se refleja en su persistencia en la población humana,
infectando a un cuarto de la población mundial y siendo capaz de mantenerse en el
infectado por años de manera asintomática en estado latente. La proteína 16-kDa alphacrystallin (Acr), es un antígeno de Mtb reconocido en pacientes con TB activa y expresada
en niveles elevados en el estado de latencia, siendo un factor de virulencia necesario para
la colonización y evasión del sistema inmune. Mtb ataca las mucosas de las vías
respiratorias, por lo que es necesario generar una respuesta inmune adaptativa con altos
niveles de anticuerpos especializados en mucosas. IgA es el principal anticuerpo residente
en las mucosas, participando en la inhibición de la adherencia bacteriana y la
neutralización de toxinas y virus. El desarrollo de la respuesta inmune mucosal está
asociado a la captación de antígenos por las células M, las cuales se encargan de iniciar la
respuesta mucosal. Se ha descrito al péptido sintético Co1 como un ligando al receptor 5a
presente en las células M, facultando el diseño de vehículos promotores de una respuesta
mucosal. En este trabajo, la proteína Acr y el péptido Co1 se expresaron en la superficie
del fago filamentoso M13, un virus bacteriano reconocido por infectar a Escherichia coli
y de replicarse sin provocar la lisis bacteriana. Los bacteriófagos se inocularon en ratones
C57BL/6 por la vía oral y subcutánea y se evaluó el desarrollo de anticuerpos IgA e IgG,
demostrando que el bacteriófago M13 actúa como un carrier vacunal de la proteína Acr
y que el péptido Co1 tiene un efecto directo en los niveles de anticuerpos generados.
Descripción : Tesis para optar al grado académico de Magíster en Biotecnología Molecular.2022-01-01T00:00:00ZRol de 2-AG en tanicitos y su participación durante la ingesta alimenticia.Palma Chávez, Alejandra Elizabethhttp://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/9332023-11-10T23:41:17Z2019-01-01T00:00:00ZTítulo : Rol de 2-AG en tanicitos y su participación durante la ingesta alimenticia.
Autor : Palma Chávez, Alejandra Elizabeth
Resumen : El sistema endocannabinoides (SE) es un sistema de señalización ampliamente expresado en
el cerebro y tejidos periféricos involucrados en la ingesta alimenticia como por ejemplo, el
hipotálamo. En el hipotálamo, específicamente en el núcleo arqueado se encuentran grupos de
neuronas con funciones antagónicas que modulan la ingesta alimenticia. Estas son las
neuronas orexigénicas (NPY/AgRP) que promueven la ingesta alimenticia y las neuronas
anorexigénicas (POMC/CART) que promueven saciedad. Está muy bien descrito que estas
neuronas se mantienen estrecho contacto con células gliales gluco sensoras que rodean el 3V
del hipotálamo llamadas tanicitos, estas son fundamentales a la hora de modular la ingesta
alimenticia en base a los niveles de nutrientes como glucosa. Si bien, se ha descrito la expresión
de diferentes componentes del SE en el hipotálamo como por ejemplo, receptores
cannabinoides, enzimas de síntesis y degradación de endocannabinoides, solo existe una
investigación que indica que en los tanicitos se expresa la enzima DAGLa encargada de
producir el endocannabinoide 2-AG, sin existir evidencia sobre el rol de esta enzima de tanicitos
en la conducta alimenticia. En esta tesis disminuimos la expresión de la DAGLa de tanicitos
mediante un adenovirus shARNDAGLa. Además, utilizamos como estrategia farmacológica un
inhibidor enzimático selectivo para esta enzima. Se observó que el adenovirus presenta
aproximadamente un 50% de inhibición tanto en ARNm como de proteína en estudios in vivo a
120 horas de transducción. Los niveles de neuropéptidos anorexigénicos y orexigénicos no
responden de la misma manera que el adenovirus control, y tampoco responden con el inhibidor
a altas concentraciones de glucosa i.c.v. Además, el estudio preliminar de comportamiento
alimenticio indica que los animales DAGLa inhibidos se encuentran en un estado de menor
hambre y/o mayor saciedad que ratas control después de un ayuno prolongado. Los resultados
de este trabajo de tesis, sugieren que la alteración en los niveles de neuropéptidos en ayuno
como en saciedad son mediados por el silenciamiento de DAGLa en los tanicitos, lo que apoya
la hipótesis de que la enzima productora de 2-AG jugaría un rol relevante en la conducta
alimenticia no descrito hasta la fecha.
Descripción : Tesis para optar al grado de Magíster en Bioquímica y Bioinformática.2019-01-01T00:00:00Z