DSpace Colección :http://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/74152024-03-28T10:54:48Z2024-03-28T10:54:48ZDesarrollo y Caracterización de un prototipo de hormona folículo estimulante bovina de simple cadena (BscFSH), para reproducción asistida en rumiantes.Cabezas Ávila, Oscar Ignaciohttp://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/108592023-11-10T23:40:51Z2023-01-01T00:00:00ZTítulo : Desarrollo y Caracterización de un prototipo de hormona folículo estimulante bovina de simple cadena (BscFSH), para reproducción asistida en rumiantes.
Autor : Cabezas Ávila, Oscar Ignacio
Resumen : La transferencia de embriones permite la diseminación de características genéticas desde animales de alto rendimiento hacia los rebaños bovinos de producción, tanto lecheros como de carne. Para su uso se implementan protocolos de superovulación, que actualmente, utilizan diversas glicoproteínas que no son especie específicas, siendo la hormona folículo estimulante (FSH) extraída de pituitaria de cerdo, la más utilizada actualmente. Sin embargo, esta FSH porcina tiene varias limitantes. Entre ellas, una vida media en circulación de 5 h, contaminación de hormona luteinizante y otras proteínas del extracto, se realizan 8 frecuencias de aplicación en 4 días, lo que precisa un mayor manejo animal y genera estrés, incidiendo significativamente en la respuesta ovárica y la obtención de embriones transferibles. En este trabajo se diseñó y caracterizó una variante recombinante de cadena única, derivada de la hormona folículo estimulante bovina (bscFSH). Esta variante se diseñó considerando las secuencias aminoacídicas de las cadenas alfa y beta de la FSH nativa de Bos taurus, covalentemente unidas mediante un espaciador de 33 aminoácidos y conteniendo un total de 6 sitios potenciales de N-glicosilación, con estructuras altamente sialiladas. La hormona se produjo en un clon de células CHO genéticamente transformadas y se purificó en un único paso de cromatografía de afinidad, obteniéndose con un 97% de pureza. La bscFSH presentó un tiempo medio de residencia de 66,44 h y un tiempo de vida media en circulación de 44,16 h, administrada por vía intramuscular. Esto nos permitió desarrollar protocolos de superovulación en bovinos con la mitad de la frecuencia de aplicaciones (4 administraciones) utilizada actualmente con las FSH derivadas de pituitaria de cerdo, y obteniendo una mayor cantidad de embriones transferibles. La nueva hormona desarrollada induce una respuesta ovárica eficiente, permite un manejo más amigable, tiene un alto nivel de pureza y está libre de contaminantes animales, evitando posibles zoonosis, y disminuyendo la respuesta inmune y estrés animal.; Embryo transfer allows the dissemination of genetic characteristics from highyielding animals to production cattle herds, both dairy and beef. For its use, superovulation protocols are implemented, which currently use various glycoproteins that are not specific, being the follicle-stimulating hormone (FSH) extracted from pig pituitary, the most currently used. However, this porcine FSH has several limitations. Among them, a circulating half-life of 5 h, contamination of luteinizing hormone and other extract proteins, 8 application frequencies are carried out in 4 days, which requires greater animal handling and generates stress, significantly influencing the ovarian response and the obtaining of transferable embryos. In this work, a single-chain recombinant variant derived from bovine follicle stimulating hormone (bscFSH) was developed and characterized. This variant was designed by considering the amino acid sequences of the alpha and beta chains of native Bos taurus FSH, covalently linked by a 33-amino acid spacer and containing a total of 6 potential N-glycosylation sites, with highly sialylated structures. The hormone was produced in a clone of genetically transformed CHO cells and was purified in a single affinity chromatography step, obtaining 97% purity. bscFSH had a mean residence time of 66.44 h and a circulating half-life of 44,16 h when administered intramuscularly. This allowed us to develop bovine superovulation protocols with half the frequency of applications (4 administrations) currently used with pig pituitary-derived FSH, and obtaining a greater number of transferable embryos. The newly developed hormone induces an efficient ovarian response, allows friendlier handling, has a high level of purity and is free of animal contaminants, avoiding possible zoonoses, and reducing the immune response and animal stress.
Descripción : Tesis presentada para optar al grado de Doctor en Biotecnología Molecular.2023-01-01T00:00:00ZAsociación de SALL2 y vía WNT/β-CATENINA en cáncer de colon.Quiroz Lagos, Aracelly Scarlethttp://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/107602023-11-10T22:51:08Z2023-01-01T00:00:00ZTítulo : Asociación de SALL2 y vía WNT/β-CATENINA en cáncer de colon.
Autor : Quiroz Lagos, Aracelly Scarlet
Resumen : SALL2 es un factor de transcripción implicado en el desarrollo embrionario, y
funcionalmente se relaciona con la regulación de la proliferación, migración y supervivencia celular. Análisis de datos masivos de cáncer versus tejidos normales indican que el ARNm de SALL2 se encuentra significativamente disminuido en el cáncer colorrectal (CCR), un tipo de cáncer caracterizado por la hiperactivación de la vía Wnt/β-catenina. De manera interesante, análisis previos de Inmunoprecipitación de cromatina-secuenciación (ChIPseq) del laboratorio sugirien que SALL2 regula genes asociados con la vía Wnt. Sin embargo, a la fecha no se ha caracterizado la expresión proteica de SALL2 en tejidos de colon normal o CCR. Por otra parte, se desconoce el rol de SALL2 en CCR y su relación con la vía Wnt. Para caracterizar la expresión de SALL2 en tejidos de colon, se construyó un tissue microarray usando 130 biopsias de archivo del Hospital Guillermo Gantt Benavente
incluyendo colon normal, adenoma y CCR, y se evaluó la expresión y localización de SALL2 mediante inmunohistoquímica. Encontramos que SALL2 se expresa en el núcleo y el citoplasma del epitelio, y en el estroma del colon normal se expresa en fibroblastos. Sin embargo, su expresión está disminuida en el adenoma y ausente en el CCR, coincidiendo con los resultados bioinformáticos previos. En biopsias de CCR observamos una
correlación negativa entre la expresión de SALL2 y la expresión de β-catenina nuclear en el frente migratorio, un marcador pronóstico. Esta correlacion se confirmó en células CCR con ganancia y pérdida de función de SALL2 a través de inmunofluorescncia y fraccionamiento subcelular. Además, evaluamos la dependencia de SALL2 en la expresión de blancos de la vía Wnt por Western blot y qRT-PCR, encontrando una correlación positiva entre SALL2 y AXIN2, un importante regulador negativo de la vía Wnt. El análisis del promotor de AXIN2 identificó varios sitios de unión putativos de SALL2. A nivel mecanístico demostramos que la inducción de SALL2 en modelos celulares doxiciclina inducible, aumenta la actividad del promotor de AXIN2. A través de ChIP-PCR demostramos que SALL2 se une a la porción proximal del promotor de AXIN2, lo que confirma una regulación transcripcional dependiente de SALL2. Finalmente, mostramos que el eje SALL2-AXIN2 es necesario para la respuesta de supervivencia a XAV939, un inhibidor de la vía Wnt. En conclusión, nuestro estudio confirma que SALL2 regula positivamente la transcripción de AXIN2. Se propone que la pérdida de la expresión de SALL2 durante la progresión del CCR contribuye a la disminución de los niveles de AXIN2, lo que contribuye a la hiperactivación de la vía Wnt.; SALL2 is a developmental transcription factor involved in the regulation of cell Proliferation, migration, and survival. Massive data analyses of cancer versus normal tissues indicated that SALL2 mRNA significantly decreases in colorectal cancer (CRC), a cancer type characterized by Wnt pathway hyperactivation. Interestingly, our unpublished ChIP-seq data analyses suggested that SALL2 regulates genes associated with the Wnt pathway, involved in the development and progression of solid tumors, including CRC. However, the role of SALL2 in CRC and its relationship with the Wnt pathway are yet unknown. We constructed a tissue microarray of 130 samples from Guillermo Gantt Benavente’s Hospital comprising normal colon, adenoma, and CRC to evaluate the expression and cellular location of SALL2 in normal tissues and during CRC progression by immunohistochemistry. We found that SALL2 expresses in the nucleus and cytoplasm of the normal colon epithelium and the stroma. However, its expression decreases in adenoma and is absent in CRC. We noted a negative correlation between SALL2 expression and the expression of nuclear β-catenin, a marker of progression and activation of the Wnt pathway, at the migratory front. Subcellular fractionation and immunofluorescence experiments in CRC cells with gain and loss of SALL2 function support the negative correlation between SALL2 expression and nuclear β-catenin. Additionally, we evaluated the expression of Wnt targets by Western blot and qRT-PCR, finding a positive correlation between SALL2 and AXIN2, a negative regulator of the Wnt pathway.Analysis of AXIN2 promoter identified several putative SALL2 binding sites, and the induction of SALL2 increases AXIN2 promoter activity in SALL2 knockout models. In addition, using ChIP-PCR we found that SALL2 binds to the proximal region in AXIN2 promoter, confirming a SALL2- dependent transcriptional regulation. Finally, we show that the SALL2-AXIN2 axis is required for the antiproliferative, and apoptotic response to XAV939, an inhibitor of the Wnt pathway. In conclusion our study confirms that SALL2 positively regulates the transcription of AXIN2. We proposed that the loss of SALL2 expression during CRC progression contributes to the decrease of AXIN2 levels, and the hyperactivation of the Wnt pathway.
Descripción : Tesis para optar al grado de Doctor en Ciencias Biológicas Área Biología Celular y Molecular.2023-01-01T00:00:00ZAumento en la expresión de P2X2 inducido por el péptido aβ, su impacto en la endocitosis de APP y en la distribución de Fe65 en la enfermedad de alzheimer.Godoy Rivera, Pamela Andreahttp://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/98572023-11-11T00:13:08Z2021-01-01T00:00:00ZTítulo : Aumento en la expresión de P2X2 inducido por el péptido aβ, su impacto en la endocitosis de APP y en la distribución de Fe65 en la enfermedad de alzheimer.
Autor : Godoy Rivera, Pamela Andrea
Resumen : La Enfermedad de Alzheimer (EA) es el principal tipo de demencia que afecta a la población adulta mayor y se postula que el principal agente tóxico en la patología de esta enfermedad neurodegeneratitva es el péptido β-amiloide (Aβ). Específicamente, serían los oligómeros solubles del péptido (Aβo) los que provocan los principales efectos neurotóxicos como son la falla sináptica y disfunción mitocondrial. Además, se ha propuesto que estos oligómeros son capaces de formar un poro no selectivo en la membrana plasmática, lo que genera entre otras cosas, la dishomeostasis del Ca2+ intracelular. En nuestro grupo se pudo establecer que este poro también permite la salida de ATP al medio extracelular, potenciando el rol de esta molécula como neurotransmisor, y por ese motivo, en este trabajo quisimos estudiar el impacto que ese incremento tendría en la señalización purinérgica.
Es conocido que los receptores purinérgicos cumplen diferentes roles en la comunicación celular en el sistema nervioso central, y en particular, los receptores ionotrópicos P2XR, han sido descritos en roles tan relevantes como la neuroinflamacion (P2X7R), en esta misma familia se encuentra el P2X2R, asociado a una función principalmente neuronal, y cuyas dos isoformas principales son P2X2a y P2X2b. La primera contiene la secuencia completa de la proteína, mientras que la segunda no tiene 69 aminoácidos del extremo C-terminal; cabe señalar que por este motivo solo P2X2a interacciona con Fe65, proteína adaptadora que transloca al núcleo donde activa la transcripción del coactivador 1 α del receptor activado por proliferadores de peroxisoma (PGC-1α), regulador maestro de la biogénesis mitocondrial, entre otros. En paralelo, Fe65 puede interaccionar adicionalmente, con la proteína precursora amiloide (APP), y se postula que regula el tráfico y procesamiento proteolítico de esta. APP puede ser proteolizada por la vía amiloidogénica (que da origen al péptido Aβ) y no amiloidogénica. Ambos procesamientos ocurren en distintos compartimentos celulares; la vía amiloidogénica ocurre principalmente en compartimentos con pH más ácido, como endosomas, mientras que la no amiloidogénica ocurre principalmente en la membrana plasmática. Por este motivo, el tráfico y endocitosis de APP son eventos celulares relevantes para la producción del péptido Aβ, que podrían condicionar la toxicidad amiloide y la fisiopatología de la EA.
Este trabajo se basa en la evidencia previa del laboratorio, donde se ha demostrado la sobreexpresión de P2X2R tras la exposición a Aβo, y se enfocó en estudiar posibles consecuencias celulares y moleculares, asociadas a este aumento de la expresión de P2X2R. De los resultados obtenidos, confirmamos que P2X2R aumenta en modelos celulares tratados con Aβo y en el cerebro de pacientes con la EA. Específicamente, nuestros estudios en modelos celulares, nos sugieren que la isoforma P2X2a se expresa principalmente. Además, observamos que tanto la exposición a Aβo como la sobreexpresión de P2X2a, generan una disminución de la razón núcleo-citosol (N-C) de Fe65 y en los niveles totales de PGC-1α. Finalmente, en neuronas hipocampales expuestas a Aβo observamos un aumento en la co-localización de APP con Rab5, un marcador de endosomas tempranos, que sugiere un aumento en la endocitosis de esta proteína. Mientras que en células PC12 observamos un aumento en los niveles de Aβ luego de la sobreexpresión de P2X2R.
En resumen, nuestros resultados nos permiten plantear la participación del P2X2R, y de la neurotransmisión purinérgica, como elementos relevantes en los mecanismos fisiopatológicos desencadenados por Aβo en la EA, que involucran cambios en reguladores de la función mitocondrial, y del proceso endocitico de APP, con lo cual el P2X2R, se presenta como una nueva e interesante diana farmacológica para el desarrollo de nuevas estrategias experimentales, que reduzcan la toxicidad del péptido amiloide, o frenen el ciclo de toxicidad mediado por la mayor producción de Aβ. Se requerirá avanzar en estudios adicionales, que profundicen en los mecanismos que activan la sobreexpresión de los receptores purinérgicos, y los elementos involucrados en la activación de la vía amiloidogenica.
Descripción : Tesis presentada para optar al grado de Doctora en Ciencias Biológicas Área Biología Celular y Molecular.2021-01-01T00:00:00ZBuscando las bases moleculares y funcionales para explicar la entrada de vitamina C al cerebro a través de los plexos coroideos.Ulloa Jofré, Viviana Angélicahttp://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/49552023-11-11T00:12:35Z2009-01-01T00:00:00ZTítulo : Buscando las bases moleculares y funcionales para explicar la entrada de vitamina C al cerebro a través de los plexos coroideos.
Autor : Ulloa Jofré, Viviana Angélica
Resumen : Los plexos coroideos forman la barrera sangre-LCR y las células epiteliales de los plexos sintetizan el LCR y regulan la entrada y la salida de numerosos compuestos en el SNC. La acumulación de ascorbato en el cerebro ocurre a través del cotransportador de sodio-ascorbato SVCT2, tal como quedó demostrado en los ratones knock-out para este transportador. Estos ratones presentan niveles de vitamina C prácticamente indetectables en el cerebro y mueren pocos minutos después de nacer. La expresión de SVCT2 en los plexos coroideos y estudios funcionales realizados in vivo e in vitro, sugieren que la captación de ascorbato desde el plasma es mediada por SVCT2 en la membrana basolateral de las células epiteliales de los plexos coroideos, para ser posteriormente liberado al LCR. Además, se ha demostrado que la forma oxidada de la vitamina C o ácido deshidroascórbico, corresponde a un escaso porcentaje
de vitamina C circulante, y puede ser captado a través de algunas isoformas de transportadores facilitativos de hexosas, GLUTs.
En esta tesis analizamos la expresión y localización de SVCT2 en los plexos coroideos normales y en distintas condiciones in vivo e in vitro y evaluamos la función de SVCT2 y GLUT1 en la incorporación de ambas formas de la vitamina C en células de plexos coroideos en cultivo. Definimos la expresión y localización de SVCT2 realizando ensayos de RT-PCR, Western blot e inmunocitoquímica en explantes de plexos coroideos de ratón, además de analizar la localización en cobayos normales y en cobayos deficientes en vitamina C. Los análisis funcionales de la incorporación de ascorbato y ácido deshidroascórbico se realizaron en células humanas de papiloma de plexos coroideos.
Nuestros resultados demuestran la polarización basolateral de SVCT2 en las células epiteliales de los plexos coroideos de ratón, incluso en el desarrollo postnatal temprano. Utilizando una inyección intracerebroventricular de lentivirus,logramos sobreexpresar hSVCT2-EYFP en células epiteliales de los plexos,confirmando in vivo y en un contexto de células normales (no transformadas) la polarización basolateral de SVCT2. En las células de papiloma de plexos
coroideos definimos los parámetros cinéticos para la captación de ascorbato y ácido deshidroascórbico. La incorporación de la forma oxidada de la vitamina C,se incrementa fuertemente al realizar el cocultivo de células de plexos con neutrófilos estimulados con PMA, generadores de oxidantes.
Nuestros datos muestran que vitamina C puede ser incorporada en los plexos coroideos utilizando transportadores SVCT2 o GLUT1, polarizados basolateralmente.
Descripción : Tesis para optar al grado de Doctor en Ciencias Biológicas, área Biología Celular y Molecular.2009-01-01T00:00:00Z