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http://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/7412
2024-03-28T18:14:47ZRol de IIIG9 en la mantención de uniones adherentes y la polaridad de células ependimarias normales.
http://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/11563
Título : Rol de IIIG9 en la mantención de uniones adherentes y la polaridad de células ependimarias normales.
Autor : Oviedo Iturra, María José
Resumen : IIIG9 (PPP1R32/SAXO4) es la subunidad regulatoria 32 de la proteína fosfatasa-1 (PP1) de la cual existe escasa información sobre su función. En el sistema nervioso central (SNC) adulto, presenta una localización restringida a cilios móviles, en las uniones adherentes y el citosol de las células ependimarias. Reportes preliminares de esta tesis indicaron que la inhibición in vivo de IIIG9 en la pared ventricular adulta genera denudación ependimaria parcial y presencia de células no polarizadas que internalizan las cadherinas. Sin embargo, hasta la fecha se desconoce un mecanismo molecular que explique la acción de IIIG9 en los complejos proteicos que estabilizan las uniones adherentes. Además, es desconocida la relevancia de IIIG9 en la mantención de las uniones adherentes en las células progenitoras de la pared ventricular, llamadas glias radiales (RGC), y sus efectos en la formación de neuronas y otros tipos de células gliales, como astrocitos. En esta tesis postulamos que IIIG9 forma un complejo con la proteína fosfatasa-1 alfa y Par-3 (proteína de polaridad celular), promoviendo la mantención de las uniones adherentes durante la polarización y diferenciación de las células ependimarias. En el primer objetivo determinamos que IIIG9 se induce tempranamente en el periodo embrionario (E11), con una distribución polarizada hacia el cuerpo de la glia radial, junto a las cadherinas, PP1 alfa y Par-3. La distribución polarizada de estas proteínas se mantiene en la etapa postnatal (PN) y en el epéndimo adulto. Mediante análisis de inhibición in vivo en animales embrionarios (inyección adenoviral en E16 y análisis en cerebros PN4) reportamos un fenotipo de heterotopia ventricular, representado por cúmulos celulares que expresan marcadores de diversos linajes (glias radiales, precursores neurales y gliales). Este efecto fue acompañado de cambios en el patrón de distribución de las cadherinas respecto a la condición control. En zonas marginales de la corteza cerebral, se observaron cúmulos celulares sugiriendo la presencia de heterotopia cortical, rodeada de astrogliosis reactiva. Además, se observa una reducción del área inmunoreactiva para GFAP que sugiere una reducción en la población de astrocitos marginales. En nuestro segundo objetivo, reportamos la interacción entre IIIG9/E-cadherina, IIIG9/PP1 y Par-3/E-cadherina a nivel de los cilios y las regiones basolaterales de las células ependimarias. Similar a lo que observamos en un modelo in vitro de células MDCK polarizadas. Finalmente, mediante análisis de FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) determinamos la interacción entre IIIG9 y PP1 alfa en células HEK292T. En conclusión, nuestros hallazgos indican que IIIG9 (PPP1R32/SAXO4) promueve la mantención de la polaridad de la glía radial (célula troncal) y de las células ependimarias, a través de las uniones adherentes. Esta función podría ser dependiente de la interacción de IIIG9 con cadherinas, PP1y posiblemente con Par-3. Así la correcta función de IIIG9 podría limitar la aparición de patologías del desarrollo cerebral como la dislexia, la epilepsia, el autismo, entre otras; y del cerebro adulto como la hidrocefalia.; IIIG9 (PPP1R32/SAXO4) is the regulatory subunit 32 of protein phosphatase-1 (PP1), with limited functional information. In the adult CNS, this protein specifically localizes to motile cilia, adherens junctions and ependymal cells cytosol. Preliminary reports of this thesis indicated that in vivo inhibition of IIIG9 in the adult ventricular wall generates partial ependymal denudation and the presence of non-polarized cells that internalize cadherins. These findings indicate that IIIG9 plays a crucial role in maintaining adherens junctions in ependymal cells; however, a molecular mechanism explaining its key role in the stabilization of these junctions has not been reported to date. Additionally, the significance of IIIG9’s maintenance role is currently unknown for ventricle wall progenitor cells, known as radial glias, nor during the formation of neurons and other types of glial cells, such as astrocytes. In this thesis, we postulate that IIIG9 forms a complex with PP1 (protein phosphatase 1 alpha) and Par-3 (a cell polarity protein), contributing to the maintenance of adherens junctions during the polarization and differentiation of ependymal cells. In the first objective, we report that IIIG9 is induced early at the embryonic stage (E11), having a polarized distribution towards the body of the radial glia, along with cadherins, PP1 and Par-3. This polarized distribution is maintained during the postnatal stage and in the adult ependyma. Through in vivo inhibition analysis in embryonic animals (adenoviral injection at E16 and analysis in PN4 brains) we report a phenotype of ventricular heterotopia, represented by cell clusters that express markers of various lineages (radial glia, neural and glial precursors). In these animals, we observe changes in the distribution pattern of cadherins compared to the control. In marginal zones of the cerebral cortex, cell clusters were observed, suggesting the presence of cortical heterotopia, surrounded by reactive astrogliosis. Moreover, it was observed a reduction in the immunoreactive zone for GFAP, suggesting a drop in the marginal astrocyte population. In our second objective, we report the interaction between IIIG9/E-cadherin, IIIG9/PP1 and Par-3/E-cadherin at the ciliary level and on the basolateral regions of ependymal cells. These observations were similar to the polarized model of MDCK cells in vitro. Finally, using FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) we inform the interaction between IIIG9 and PP1 in HEK292T cells. In conclusion, our findings indicate that IIIG9 (PPP1R32/SAXO4) promotes the maintenance of radial glial (troncal cell) and ependymal cell polarity, via adherens junctions. This function could depend on the interaction of IIIG9 with cadherins, PP1 and possibly with Par-3. The correct functioning of IIIG9 could be a key factor in limiting the emergence of brain development pathologies such as dyslexia, epilepsy, autism, during development, and at the adult brain such as hydrocephalus.
Descripción : Tesis presentada para optar al grado de Doctorado en Ciencias Biológicas, área Biología Celular y Molecular.2023-01-01T00:00:00ZCambios en la expresión y función del receptor de glicina en el Núcleo Accumbens durante el envejecimiento.
http://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/11405
Título : Cambios en la expresión y función del receptor de glicina en el Núcleo Accumbens durante el envejecimiento.
Autor : Konar Nié, Macarena Sofía
Resumen : El Núcleo accumbens (nAc) es una estructura cerebral clave en el sistema de recompensa. El nAc recibe e integra señalización aferente principalmente excitatoria originada desde diversas regiones del cerebro. El control inhibitorio es mediado por los receptores de ácido gama aminobutírico (GABAA) y los receptores de Glicina (GlyR). Reportes de nuestro laboratorio demostraron la presencia de corrientes sinápticas glicinérgicas, provenientes de una región cerebral no identificada aún. Este proyecto tuvo como objetivo general determinar los cambios en la transmisión glicinérgica en el nAc durante el envejecimiento; donde se plantearon dos objetivos específicos: OS1: Caracterizar la expresión temporal y sub-celular de los GlyRs en el nAc de ratones adultos y envejecidos. OS2: Caracterizar la presencia y funcionalidad de la(s) aferencias glicinérgicas que llegan hasta el nAc de ratones adultos y envejecidos. Se encontró, usando Western blot, que los animales envejecidos de 12 y 18 meses muestran una reducción significativa en la subunidad β del GlyR, la cual permite al receptor anclarse a la sinapsis y una disminución en el ARNm de la subunidad α2 y α3 usando PCR cuantitativa. La expresión de un virus retrógrado dependiente de la recombinasa Cre en el nAc de ratones GlyT2::Cre permitió determinar que la inervación glicinérgica que recibe el nAc proviene de la sustancia gris periacueductal lateral (lPAG). Esta inervación mostró ser discreta y no se vio sustancialmente afectada a nivel estructural durante el envejecimiento. Ya que la lPAG tiene un rol en comportamientos defensivos y respuestas gratificantes al alcohol, indujimos la ablación neuronal glicinérgica sitio específica en la lPAG y evaluamos el consumo de etanol. Los animales con ablación glicinérgica exhibieron una disminución significativa en el consumo de etanol, sugiriendo que las neuronas glicinérgicas de la lPAG que inervan al nAc podrían participar en la inhibición / modulación requerida para generar recompensa y/o búsqueda, en respuesta al etanol, posiblemente mediado por la aversión al sabor. El marcaje retrógrado nos permitió, además, evidenciar que la IPAG también provee de inervación glicinérgica al VTA. La comunicación lPAG-VTA-amígdala-nAc podría dar cuenta de un nuevo circuito neuronal que responde a comportamientos defensivos, aversivos y estímulos recompensantes relacionados con el sistema mesolímbico canónico. En conclusión, este trabajo de tesis da cuenta de que los GlyRs son susceptibles al envejecimiento y da cuenta de la existencia de nuevas proyecciones glicinérgicas de largo alcance que conectan el lPAG con el nAc. Estos hallazgos sugieren un papel hasta ahora desconocido de la inhibición glicinérgica y abre paso a nuevos estudios que permitan entender de manera acabada el rol de la transmisión glicinérgica en las regiones supraespinales del SNC.; The nucleus accumbens (nAc) is a key brain structure in the reward system. The nAc receives and integrates afferent signaling fr om several brain regions. Inhibitory control is mediated by gamma aminobutyric acid receptors (GABA A ) and glycine receptors (GlyR). Reports from our laboratory demonstrated the presence of glycinergic synaptic currents, coming from a brain region not yet identified. This project aimed to determine the changes in glycinergic transmission in the nAc during aging. Two specific objectives were set: SO1: Characterize the temporary and sub cellular expression of GlyRs in the nAc of adult and aged mice, and SO2: Characterize the presence and functionality of the glycinergic input(s) that reach the nAc of adult a nd aged mice. Using Western blot, animals aged 12 and 18 months were found to show a significant reduction in the β subunit of GlyR, which allows the receptor to anchor to the synapse, and a decrease in α2 and α3 subunit mRNA using quantitative PCR. The ex pression of a Cre recombinase dependent retrograde virus in the nAc of GlyT2::Cre mice allowed us to determine that the glycinergic innervation received by the nAc comes from the lateral periaqueductal gray ( l PAG). This innervation was shown to be discrete and was not substantially affected at the structural level during aging. Since l PAG has a role in defensive behaviors and rewarding responses to alcohol, we induced site specific glycinergic neuronal ablation in the l PAG and assessed ethanol consumption. Animals with glycinergic ablation exhibited a significant decrease in ethanol consumption, suggesting that l PAG glycinergic neurons innervating the nAc might participate in the inhibition/modulation required to generate reward and/or seeking in response to ethanol, possibly mediated due to taste aversion. Retrograde labeling also showed that the l PAG provides glycinergic innervation to the VTA. The l PAG VTA amygdala nAc communication could account for a new neural circuit that responds to defensive, aversiv e behaviors and rewarding stimuli related to the canonical mesolimbic system. In conclusion, this thesis work shows that GlyRs are susceptible to aging and shows the existence of new long range glycinergic projections that connect the l PAG with the nAc. Th ese findings suggest a hitherto unknown role of glycinergic inhibition and pave the way for new studies that will allow us to fully understand the role of glycinergic transmission in the supraspinal regions of the CNS.
Descripción : Tesis para optar al grado de Doctorado en Ciencias Biológicas área Biología Celular y Molecular.2023-01-01T00:00:00ZRegulación transcripcional de NUAK1 por SALL2 frente a estrés metabólico.
http://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/11272
Título : Regulación transcripcional de NUAK1 por SALL2 frente a estrés metabólico.
Autor : Álvarez Martínez-Conde, Claudia Isabel
Resumen : El estrés metabólico en cáncer es un paso crítico para la migración, invasión y metástasis. NUAK1, un miembro de la familia de quinasas relacionadas a AMPK (ARKs), se encuentra desregulado en algunos tipos de cáncer. Su sobreexpresión promueve migración, metástasis y supervivencia celular frente a distintos contex-tos, incluyendo estrés metabólico. Datos de nuestro laboratorio muestran que NUAK1 es inducido transcripcionalmente frente a la carencia de glucosa; sin embar-go, se desconocen los mecanismos que participan en esta respuesta. Se ha pro-puesto que SALL2, un factor de transcripción con roles duales en el cáncer podría estar involucrado. Aunque SALL2 generalmente actúa como un supresor tumoral, en condiciones de estrés metabólico su expresión aumenta y contribuye a la supervi-vencia en células MEF; sin embargo, el mecanismo mediante el cual SALL2 ejerce este rol no ha sido reportado. Para investigar la relación entre NUAK1 y SALL2, se realizaron análisis bioinformáticos utilizando bases de datos como miPanda y R2, los cuales mostraron una correlación positiva entre los niveles de SALL2 y NUAK1 en varios tejidos. De acuerdo con esos análisis, encontramos una dependencia de SALL2 para el incremento en la expresión de NUAK1 frente a estrés metabólico por carencia de glucosa. Con el fin de determinar si NUAK1 es un blanco directo de SALL2, se analizó el promotor de NUAK1 humano y Nuak1 de ratón, en los cuales se encontraron sitios consenso de unión a SALL2 conservados entre ambas especies. Ensayos de gen reportero de luciferasa demostraron que la ganancia de función de SALL2 incrementa la actividad del promotor Nuak1, mientras que estudios de inmu-noprecipitación de cromatina (ChIP) demostraron que SALL2 se une al promotor NUAK1. Al comprobar el rol pro-supervivencia de SALL2 ante estrés metabólico en diferentes modelos, se encontraron tendencias controversiales. Solo se observó el incremento en la supervivencia celular dependiente de SALL2 en modelos de pérdida de función (silenciamiento), y la tendencia fue similar a los datos previos usando células MEF silvestres y deficientes de Sall2. Más aún, nuestros estudios sugieren que existe una dependencia de NUAK1 para el rol pro-supervivencia de SALL2. De forma interesante, la inhibición de NUAK1 en condiciones de alta glucosa, induce la formación de vacuolas que se corresponden con el fenotipo de un tipo de muerte ce-lular conocida como methuosis, las cuales son más abundantes en células shCtrl respecto a las silenciadas (shSall2). Estos datos se condicen con observaciones pre-vias del laboratorio en células de cáncer de colon, asociándose SALL2 con la gene-ración de methuosis. En conjunto, nuestros datos sugieren a NUAK1 como un blanco transcripcional de SALL2 asociado a la supervivencia celular frente a estrés metabólico por carencia de glucosa. Dilucidar los mecanismos normales de regulación transcripcional de NUAK1 es esencial para comprender su desregulación en cáncer.; Metabolic stress in cancer is critical for migration, invasion, and metastasis. NUAK1, a member of the AMPK-related kinases (ARKs) family, is deregulated in some types of cancer. NUAK1 overexpression promotes cell migration, metastasis, and survival in different contexts, including metabolic stress. Data from our labora-tory show that NUAK1 is transcriptionally induced by glucose deprivation; however, the mechanisms involved in this response are unknown. It has been proposed that SALL2, a transcription factor with dual roles in cancer, may be implicated. Although SALL2 generally acts as a tumor suppressor, under conditions of metabolic stress, its expression increases and contributes to cell survival in MEF cells; however, the mechanism by which SALL2 exerts this role has not been reported. Bioinformatic analyses were performed using databases such as miPanda and R2, which showed a positive correlation between SALL2 and NUAK1 levels in several tissues. According-ly, we found SALL2 dependence for the increase of NUAK1 expression against meta-bolic stress due to glucose deficiency. To determine whether NUAK1 is a direct target of SALL2, we analyzed the promoter of human NUAK1 and mouse Nuak1, in which we found consensus SALL2 binding sites conserved in both species. Through lucifer-ase reporter gene assays, we demonstrated that SALL2 gain-of-function increas-es Nuak1 promoter activity, while chromatin immunoprecipitation (ChIP) studies showed that SALL2 binds to the NUAK1 promoter. Controversial trends were found when testing the pro-survival role of SALL2 against metabolic stress in different mod-els. The SALL2-dependent increase in cell survival was only observed in loss-of-function models (silencing), similar to previous data using wild-type and SALL2-deficient MEF cells. Moreover, our results suggest a dependence on NUAK1 for the pro-survival role of SALL2. Interestingly, NUAK1 inhibition under high glucose conditions induced vacuole formation corresponding to the phenotype of a type of cell death known as methuosis, which is more abundant in shCtrl cells than silenced (shSall2) cells. These data are consistent with previous observations from the labora-tory in colon cancer cells, associating SALL2 with the generation of methuosis. Our data suggest NUAK1 as a transcriptional target of SALL2 associated with cell survival under metabolic stress by glucose deprivation. Elucidating the nor-mal mechanisms of transcriptional regulation of NUAK1 is essential to understanding its dysregulation in cancer.
Descripción : Tesis para optar al grado de doctor en Ciencias Biológicas, área Biología Celular y Molecular.2023-01-01T00:00:00ZEvaluación de la capacidad de protección temprana de la variante Thiverval del virus de la Peste Porcina clásica y del rol de CD46 durante su entrada a la célula.
http://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/11222
Título : Evaluación de la capacidad de protección temprana de la variante Thiverval del virus de la Peste Porcina clásica y del rol de CD46 durante su entrada a la célula.
Autor : Lamothe Reyes, Yaneysis
Resumen : La Peste Porcina Clásica es una enfermedad viral multisistémica que afecta exclusivamente a cerdos y genera pérdidas económicas significativas. Su agente causal, el virus de la Peste Porcina Clásica, es un virus en cuya envoltura se hayan expuestas las proteínas Erns, E1 y E2, involucradas en la unión inicial y entrada a la célula. Sin embargo, es la interacción de E2 con uno o más receptores en la membrana celular lo que media la endocitosis del virus. De acuerdo a la evidencia, la proteína de membrana CD46 está implicada en este proceso, aunque se ha observado que algunas variantes virales, luego de la adaptación a cultivo celular, desarrollan mecanismos de infección independientes de esta proteína. Se desconoce si estas variantes emplean mecanismos diferentes para el ingreso a la célula y si existen modificaciones en la proteína E2 que podrían dar cuenta de este fenómeno. La vacunación constituye una alternativa viable para contener la diseminación del virus y eventualmente erradicarlo de aquellas regiones del mundo en donde aún permanece endémico. En estos contextos son ampliamente utilizadas las vacunas vivas modificadas, basadas en variantes del virus que han sido atenuadas luego de numerosos pases en cultivo. Sin embargo, se ha reportado la aparición de variantes de virulencia baja o moderada en zonas en donde se lleva a cabo una política activa de vacunación. Estas nuevas variantes favorecen la permanencia del virus en la población porcina y la generación de formas crónicas y persistentes de la enfermedad. Se cree que la presión inmunológica ejercida contra vacunas utilizadas durante muchos años, como es el caso de aquellas basadas en la cepa-China, ha contribuido a este fenómeno. Por lo tanto existe la necesidad de evaluar nuevas alternativas vacunales que sean igualmente seguras y eficaces en estos escenarios. Thiverval es una variante atenuada del virus de la Peste Porcina Clásica aprobada por la Organización Mundial de Salud Animal para la vacunación contra la enfermedad. Sin embargo, los reportes de seguridad y eficacia luego estudios in vivo con esta variante, datan de los años 70 y fueron obtenidos con técnicas desactualizadas a la fecha. Además, se desconoce si la variante puede transmitirse hacia animales no vacunados, cuál es su tasa de replicación en tejidos y órganos, y su capacidad de conferir protección clínica y virológica en un tiempo menor a 7 días luego de una dosis simple. La actualización de la información referente a esta variante y la evaluación de su capacidad de conferir protección temprana pueden favorecer el uso de vacunas basadas en esta cepa en entornos en donde se ha dificultado el control de la enfermedad. Por otro lado, se desconoce si las mutaciones que condujeron a la atenuación de esta variante generan cambios en la interacción con CD46. Este conocimiento constituye una herramienta útil para el potencial desarrollo de variantes virales que puedan ser utilizadas como vacunas, empleando métodos que modifiquen directamente el mecanismo de ingreso del virus con posible uso transversal en otras enfermedades veterinarias. Por tanto, el objetivo general de esta investigación fue evaluar la capacidad de protección temprana de la variante Thiverval del virus de la Peste Porcina Clásica y el rol de CD46 durante su entrada a la célula. Para la evaluación del efecto protector de la vacuna, dos grupos de animales fueron inmunizados con la variante Thiverval con 16 días de diferencia y se incluyó además en el estudio un grupo contacto y otro control. Todos los animales fueron desafiados con Margarita, variante altamente virulenta del VPPC, transcurridos 21 o 5 días post se replica en el organismo de manera controlada, sin generar viremia ni transmisión detectable hacia el grupo contacto. Además induce la expresión de IFN-α y la respuesta humoral contra E2 y Erns, las principales proteínas de la envoltura del virus. Los anticuerpos generados tienen capacidad neutralizante y son detectados desde el día 14 post inmunización. Se alcanza protección clínica completa contra los síntomas exacerbados de la enfermedad con solo 5 dpi. Además, la formulación controla la replicación del virus del desafío, protegiendo virológicamente a los animales. El rol de CD46 durante la infección viral fue evaluado in vitro incubando previamente las células con diluciones de un suero hiperinmune antiCD46 antes de la adición de Thiverval. Una dilución 1/20 no generó la inhibición completa de la infección por Thiverval, sin embargo, cuando se empleó la variante Margarita, el porciento de infección fue prácticamente nulo. Esto sugiere la existencia de mecanismos de ingreso independientes de CD46 luego de la atenuación. Un análisis in silico de la estructura de E2 de la variante Thiverval evidenció cómo las mutaciones en la región definida previamente como importante para la interacción con CD46 que podrían estar afectando la interacción con el receptor. Los resultados obtenidos en este trabajo demuestran la capacidad de protección temprana de la variante Thiverval contra la infección por el virus, lo cual la convierte en una alternativa atractiva para el control de la enfermedad en zonas endémicas. Además, esta investigación sienta las bases para investigar con más profundidad si las mutaciones que afectan la interacción inicial de un virus con sus receptores de entrada a la célula podrían ser responsables de su atenuación. Lo anterior abriría las puertas a la posibilidad de crear artificialmente variantes atenuadas con fines vacunales usando una aproximación basada en estructura proteica y la alteración la interacción del virus con su receptor natural.; Classical Swine Fever is a multisystemic viral disease that exclusively affects pigs and generates significant economic losses. Its causative agent, the Classical Swine Fever virus, is a virus that exposes in its envelope the Erns, E1 and E2 proteins, which are involved in the initial union and entry into the cell. However, it is the interaction of E2 with one or more receptors on the cell membrane that mediates endocytosis of the virus. According to the evidence, the CD46 membrane protein is involved in this process, although it has been observed that some viral variants, after adaptation to cell culture, develop infection mechanisms independent of this protein. It is unknown if these variants use different mechanisms to enter the cell and if there are modifications in the E2 protein that could account for this phenomenon. Vaccination is a viable alternative to contain the spread of the virus and eventually eradicate it from those regions of the world where it remains endemic. In these contexts, modified live vaccines are widely used, based on virus variants that have been attenuated after numerous passages in culture. However, the appearance of variants of low or moderate virulence has been reported in areas where an active vaccination policy is carried out. These new variants favor the permanence of the virus in the swine population and the generation of chronic and persistent forms of the disease. It is believed that the immunological pressure exerted against vaccines used for many years, such as those based on the China-strain, has contributed to this phenomenon. Therefore, there is a need to evaluate new vaccine alternatives that are equally safe and effective in these scenarios. Thiverval is an attenuated variant of the Classical Swine Fever virus approved by the World Organization for Animal Health for vaccination against the disease. However, the safety and efficacy reports after in vivo studies with this variant date back to the 1970s and were obtained with techniques that are outdated to date. In addition, it is unknown whether the variant can be transmitted to non-vaccinated animals, its replication rate in tissues and organs, and its ability to confer clinical and virological protection in less than 7 days after a single dose. Updating the information regarding this variant and evaluating its ability to confer early protection may favor the use of vaccines based on this strain in settings where disease control has been difficult. On the other hand, it is unknown if the mutations that led to the attenuation of this variant generate changes in the interaction with CD46. This knowledge constitutes a useful tool for the potential development of viral variants that can be used as vaccines, using methods that directly modify the virus entry mechanism with possible cross-sectional use in other veterinary diseases. Therefore, the general objective of this research was to evaluate the early protection capacity of the Thiverval variant of the Classical Swine Fever virus and the role of CD46 during its entry into the cell. To assess the protective effect of the vaccine, two groups of animals were immunized with the Thiverval variant 16 days apart, and a contact group and a control group were also included in the study. All the animals were challenged with Margarita, a highly virulent CSFV variant, at 21- or 5-days post immunization (dpi). The results of this study show that the Thiverval variant has a low replication rate in the organism and that it is not transmitted to the contact group. It also induces the expression of IFN-α and the humoral response against E2 and Erns, the main proteins of the virus envelope. Neutralizing antibodies are detected from day 14 post immunization and clinical protection against exacerbated symptoms of the disease is achieved with only 5 dpi. In addition, the formulation controls viral replication after challenge, virologically protecting the animals. The role of CD46 during viral infection was assessed in vitro by pre-incubating cells with dilutions of an anti-CD46 polyclonal serum prior to the addition of Thiverval. A 1/20 dilution did not generate complete inhibition of Thiverval infection, however, when the Margarita variant was used, the infection rate was practically nil. This suggests the existence of CD46-independent entry mechanisms after attenuation. An in-silico analysis of the E2 structure of the Thiverval variant showed how the presence of mutations in the region previously defined as important for the interaction with CD46 could be affecting the interaction with the receptor. The results obtained in this work demonstrate the early protection capacity of the Thiverval variant against infection by the virus, which makes it an attractive alternative for the control of the disease in endemic areas. In addition, this research lays the groundwork for further investigation of whether mutations that affect a virus's initial interaction with its cell-entry receptors could be responsible for its attenuation. This would open the doors to the possibility of artificially creating attenuated variants for vaccine purposes using an approach based on protein structure and altering the interaction of the virus with its natural receptor.
Descripción : Tesis para optar al grado de Doctor en Ciencias Biológicas Área Biología Celular y Molecular.2023-01-01T00:00:00Z