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dc.contributor.advisorMoraga Cid, Gustavo; profesor guíaes
dc.contributor.authorFraig Lobos, David Estebanes
dc.date.accessioned2023-04-13T11:52:40Z-
dc.date.available2023-04-13T11:52:40Z-
dc.date.issued2023-
dc.identifier.urihttp://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/10697-
dc.descriptionTesis para optar al grado de Magister en Neurobiologíaes
dc.description.abstractLos receptores de ácido -aminobutírico tipo A (GABAARs) son los principales responsables de la neurotransmisión inhibitoria en el sistema nervioso central (SNC) en mamíferos. Estos receptores pertenecen a la familia de canales iónicos pentaméricos activados por ligando (pLGICs). Cada subunidad que forma el pentámero, presenta una arquitectura común entre todos los miembros de la familia, con el extremo N-terminal (ECD) expuesto hacia el exterior de la membrana, conteniendo el sitio ortostérico, un dominio transmembrana (TMD) compuesto por 4 hélices alfa (TM1-TM4), de los cuales el dominio TM1 está unido al dominio N-terminal, el dominio TM2 delimita el poro central y los dominios TM3-TM4 se encuentran unidos por una larga asa localizada en el dominio intracelular (ICD). En un contexto funcional, el ICD de los GABAARs es blanco de acción de diversas proteínas quinasas, como PKA y PKC, las cuales regulan la función, el tráfico y expresión de los GABAARs. Diversos mecanismos moleculares han sido propuestos para explicar la modulación alostérica ejercida por eventos de fosforilación. Estos mecanismos proponen un aumento en la tasa de internalización luego de un evento de fosforilación. Además, se ha propuesto que la fosforilación de residuos en el ICD impacta sobre la estructura del ECD, afectado la afinidad del receptor por su agonista. Sin embargo, aun cuando estos mecanismos parecen plausibles, la posibilidad de que los eventos de fosforilación afecten propiedades intrínsecas del canal, como la probabilidad de apertura o su conductancia no han sido estudiados de forma extensiva. En esta línea, un trabajo reciente en otro miembro de la familia, el receptor de glicina alfa 3 (GlyR 3), ha propuesto que la fosforilación del residuo serina 346, localizado en el ICD, reduce de forma significativa la conductancia del canal. Usando registros de canal único en GlyR 3 que portan una mutación fosfomimética (S346E), los autores reportaron una reducción significativa de las corrientes unitarias, sin cambios en la distribución del receptor en la superficie de la membrana plasmática. En este contexto, debido a la estrecha relación, en términos de estructura, función y farmacología que existe entre los receptores GABAARs y GlyRs es posible sugerir que los efectos inhibitorios en las corrientes unitarias mediadas por la fosforilación del residuo S346 en el receptor GlyR 3 pueden constituir un mecanismo de acción conservado en los miembros de la familia. Basados en estos antecedentes, en el presente trabajo proponemos que “La introducción de una mutación fosfomimética en el residuo S410 en el ICD de la subunidad 2 del receptor GABAA altera la sensibilidad a GABA y la conductancia unitaria del receptor”. Usando registros electrofisiológicos en la modalidad de célula completa o de canal único se evaluó el efecto de la introducción de una mutación fosfomimética (S410E) en la actividad del receptor GABAAR 12. Los estudios de la respuesta macroscópica a concentraciones crecientes de GABA, mostraron que la introducción de la mutación S410E no tuvo impacto sobre los parámetros de afinidad aparente (EC50), corrientes máximas (Imax) o densidad de corriente (J). De manera interesante, los análisis de canal único mostraron que la introducción de la mutación S410E tuvo un impacto significativo en las corrientes unitarias del canal. Este efecto no fue observado cuando se introdujo una mutación no fosfomimética (S410A), indicando un efecto específico del residuo cargado negativamente. De esta forma, el presente trabajo propone que los efectos de una fosforilación en residuos localizados en el ICD pueden ser explicados por una reducción en la conductancia unitaria del canal, el cual es un mecanismo molecular conservado en al menos, dos miembros de la familia pLGICs.es
dc.description.abstractThe -aminobutyric acid type A receptors (GABAARs) play a critical role controlling the fast inhibitory neurotransmission in the mammalian central nervous system (CNS). These receptors belong to the pentameric ligand-gated ion channels family (pLGICs). Each subunit that forms the pentamer displays a common architecture among all members of the family, with the N-terminal end (ECD) exposed to the outside of the membrane, containing the orthosteric site, a transmembrane domain (TMD) composed of 4 alpha helices, of which TM1 is linked to the N-terminal extracellular domain, TM2 delimits the central pore, and the TM3 and TM4 domains are linked by a large loop located in the intracellular domain (ICD). In a functional point of view, the ICD of GABAARs is targeted by several protein kinases, such as PKA and PKC, which regulate the function, trafficking, and expression of GABAARs. Several molecular mechanisms explaining the allosteric modulation exerted by phosphorylation events have been proposed. These mechanisms suggest an increase in the internalization rate after a phosphorylation event. In addition, it has been proposed that the phosphorylation of residues in the ICD have an impact on the structure of the ECD, affecting the affinity of the receptor for its agonist. However, even when these mechanisms seem plausible, the possibility that phosphorylation events affect intrinsic properties of the channel, such as the opening probability or its conductance, has not been extensively studied. In this context, recent work on another member of the family, the glycine receptor alpha 3 (3 GlyR), has proposed that phosphorylation of the serine 346 residue (S346), located in the ICD, significantly reduces channel conductance. Using single channel recordings in 3 GlyR carrying a phosphomimetic mutation (S346E), the authors reported a significant reduction in unitary currents, with no change in receptor distribution on the plasma membrane surface. In this context, due to the close relationship, in terms of structure, function, and pharmacology, which exists between GABAARs and GlyRs receptors, it is possible to suggest that the inhibitory effects on unitary currents mediated by the phosphorylation of the S346 residue in the a3 GlyR receptor may constitute a mechanism of action conserved in all family members. Based on this evidence, we propose that the introduction of a phosphomimetic mutation in the S410 residue in the ICD of the 2 subunit of the GABAA receptor alters the sensitivity to GABA and the unitary conductance. Using whole-cell and single-channel electrophysiological recordings, the effect of introducing a phosphomimetic mutation (S410E) on the 12 GABAAR activity was evaluated. Studies of the macroscopic response to increasing concentrations of GABA showed that the introduction of the S410E mutation had no impact on apparent affinity (EC50), maximum currents (Imax) or current density (J) parameters. Interestingly, single-channel analysis showed that the introduction of the S410E mutation had a significant impact on unitary channel currents. This effect was not observed when a non-phosphomimetic mutation (S410A) was introduced, indicating a negatively charged residue-specific effect. Thus, the present work proposes that the effects of a phosphorylation in residues located in the ICD, can be explained by a reduction in the unitary conductance of the channel, which is a molecular mechanism conserved in at least two members of the pLGICs family.-
dc.language.isospaes
dc.publisherUniversidad de Concepción.es
dc.rightsCreative Commoms CC BY NC ND 4.0 internacional (Atribución-NoComercial-SinDerivadas 4.0 Internacional)-
dc.rights.urihttps://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/deed.es-
dc.subjectCélulas Análisises
dc.subjectNeurobiologíaes
dc.subjectEstudio Neuronales
dc.titleControl de la Conductancia del Receptor GABAA por Residuos Intracelulares: Implicancias en la Regulación del Canal por Fosforilación.es
dc.typeTesises
dc.description.facultadFacultad de Ciencias Biológicases
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