Evaluación funcional de miRNA implicados en el proceso infectivo y reproductivo de Caligus rogercresseyi.

Abstract

Caligus rogercresseyi es uno de los ectoparásitos más prevalentes en la industria del salmón en Chile. Uno de los aspectos más importante de un patógeno es una capacidad de infección y reproducción. Existe evidencia que proteínas del secretoma como serpinas, tripsinas y catepsinas juegan un rol importante en la infección de un patógeno y en la interacción patógeno-hospedero. Así como otras proteínas son de importancia durante los procesos reproductivos como vitelogenina. Los avances en genómica funcional ha permitido la caracterización de genomas en especies no-modelos y específicamente de su fracción transcrita. En este punto, RNAs no-codificantes han emergido cómo los principales componentes moleculares con roles regulatorios de la expresión génica. El objetivo de este estudio fue determinar la modulación de miRNAs sobre genes de relevancia en el proceso infectivo y reproductivo de caligus. Esto se llevó a cabo mediante el estudio de predicción de interacciones entre serpina, catepsina y tripsina con el miRNA Bantam y para vitelogenina I con mir-996. Se realizó una búsqueda de secuencias en librería de cDNA específica para caligus, utilizando herramientas bioinformáticas. Para predecir los genes dirigidos por miRNAs se utilizaron los algoritmos: PITA, StarMir, RNAHidryd. La expresión diferencial entre estadios de desarrollo se realizó por qPCR. Las secuencias 3’UTR diana para la unión al miRNA fueron clonadas y secuenciadas en el vector pmirGLO. A partir de esta construcción se realizó el ensayo funcional para medir los niveles de unión del miRNAs con su secuencia diana mediante la inhibición de la expresión del gen reportero. En la evaluación de expresión por qPCR se observó para Cr_Catepsina, Cr_Tripsina y Cr_Vitelogenina, una mayor expresión en hembra, mientras que Cr_Serpina se encuentra altamenteexpresado en estado de nauplius. Según los análisis de predicción Bantam se uniría al mRNA de catepsina, serpina y tripsina con una energía de hibridación de -15,6, - 22,7 y -20,7 kcal/mol respectivamente. Para vitelogenina I fue de -10,9 kcal/mol para mir-996. Estos resultados fueron verificados in vitro en el cual no se observó ningún efecto de bantam en la actividad de la luciferasa para Cr_Serpina y Cr_Catepsina mientras que para tripsina bantam logra disminuir la actividad de la luciferasa en un 50%. Lo mismo ocurrió para vitelogenina I en el cual se observó una disminución en un 30%. De acuerdo a estos resultados se puede concluir que bantam estaría regulando de manera post-transcripcional proteínas del secretoma de C.rogercresseyi, las cuales podrían tener una función en el proceso infectivo. Además, mir-996 también podría estar participando en la regulación post-trancripcional de vitelogenina I, un gen clave en la reproducción de C. rogercressey