Determinación de la estructura del complejo Octarrelina V.1-αRep mediante cristalización por contradifusión y el efecto de mutantes de prolina en su formación.

Abstract

Octarrelinas son proteínas artificiales de más de 200 aminoácidos, diseñadas de novo con el fin de adoptar una estructura repetitiva (βα)8 conocida como TIM-barrel. Gracias a la técnica de evolución dirigida, una versión de la proteína diseñada in silico, Octarrelina V, incremento su solubilidad y estabilidad sin ver modificada su estructura. Esta nueva versión de la proteína artificial, Octarrelina V.1, presenta dentro de las 16 mutaciones introducidas, 4 residuos de prolina en su cadena aminoacídica. La estructura parcialmente resuelta mediante cristalización por difusión de vapor muestra que la proteína diseñada no se plegaba de acuerdo a lo esperado. Sin embargo, la presencia inesperada de los residuos de prolina, despertó el interés para estudiar este residuo y la relación que puede tener con las características finales obtenidas en Octarrelina V.1. Por ello la obtención de un modelo más detallado de Octarrelina V.1 en conjunto con experimentos en mutante de prolinas puede entregar información sobre la influencia de este residuo en las características obtenidas. Para lograr esto, se buscó obtener una estructura más completa del Octarrelina V.1 utilizando el ayudante de cristalización αRep mediante el método de contradifusión. Además, mutantes de Octarrelina V.1 y V con ausencia y presencia de prolinas, respectivamente, se estudiaron mediante su interacción con αRep para obtener una mayor información de este residuo. Las proteínas Octarrelina V.1 y αRep lograron ser purificadas con altos rendimientos y grados de pureza aceptables para la posterior formación de complejos in vitro. La correcta purificación del complejo permitió establecer experimentos de cristalización por contradifusión en capilares. Los cristales obtenidos por esta técnica fueron difractados por rayos X y la data obtenida permitió resolver la estructura a través de reemplazo molecular. Gracias a estos datos, la estructura alcanzada reveló un 90% de los aminoácidos de la secuencia de Octarrelina V.1, aumentando lo anteriormente resuelto mediante cristalización por difusión de vapor.