Difusión y unión de CO2 en la enzima Crotonil-CoA Carboxilasa-Reductasa mediante simulaciones de dinámica molecular.

Abstract

El CO2 es uno de los gases de invernadero más importantes y su acumulación en la atmósfera se asocia con el cambio climático. La fijación de este gas mediante enzimas para la generación de compuestos orgánicos de valor agregado presenta un desafío actual en la biocatálisis. La Crotonil-CoA Carboxilasa-Reductasa (Ccr) es una de las enzimas más eficientes en la fijación de CO2 presentando la mayor constante de velocidad catalítica y siendo además insensible a la presencia de oxígeno, a diferencia de RuBisCO, que es la enzima responsable de la fijación de CO2 para la generación de biomasa. En esta tesis se estudiaron los cambios conformacionales de Ccr para comprender la alta eficiencia de esta enzima. Ccr es un homo tetrámero que en presencia de NADPH y análogos de sustrato (sustrato, producto de carboxilación o reducción), modifica su conformación diferenciándose desde una estructura completamente simétrica a un dímero de dímeros. Cada uno de estos dímeros posee una subunidad abierta sin sustrato y una cerrada con sustrato donde ocurre la reacción. Su gran eficiencia catalítica estaría asociada a los cambios conformacionales dando origen a una reactividad parcial de sitios. Se realizaron simulaciones de dinámica molecular para estudiar cambios conformacionales de Ccr y la unión de CO2 sobre ella. Se desarrolló un método para analizar el efecto de la conformación de la subunidad sobre la concentración de CO2 en el sitio activo y así, definir sitios de unión para esta molécula. Adicionalmente se desarrolló un procedimiento que permite cuantificar el tiempo de residencia promedio de la molécula de CO2 en los sitios de unión definidos previamente. Con la información conjunta de cambios conformacionales, unión y residencia de CO2 en el sitio activo, se propuso un mecanismo catalítico para la enzima. En primer instancia se llevaron a cabo simulaciones de dinámica molecular para determinar las conformaciones de equilibrio del sistema, así como posibles cambios de estas en solución acuosa. Estas simulaciones mostraron que la presencia del sustrato, en su posición reactiva, mantiene la conformación cerrada del sitio activo. En ausencia del sustrato la subunidad presenta un cambio conformacional de apertura en la escala de decenas de nanosegundos. Se ha encontrado que existen tres residuos conservados (E151, N218 y N157) en enoil-CoA carboxilasas-reductasas (ECRs) del metabolismo primario presentes en Ccr. Al comparar con ECRs de metabolismo secundario, estos residuos no se encuentran presentes y su actividad catalítica es en promedio 20 veces más lenta. Estos residuos están en la interfaz entre ambos dímeros y se encuentran muy alejados del sitio activo. Al perturbar la interacción de estos residuos a través de mutaciones puntuales en Ccr, su eficiencia catalítica disminuye en tres órdenes de magnitud. El análisis de componen-tes principales del sistema mutante muestra que la apertura del sitio activo se vuelve más lenta y sugiere que los cambios conformacionales están directamente relacionados con la eficiencia catalítica. Para estudiar el efecto de la conformación sobre la concentración de CO2 en el sitio activo, se utilizarón simulaciones en presencia explícita de moléculas de CO2 en conformaciones representativas de la Ccr definidas anteriormente. Se analizaron las distribuciones de moléculas de CO2 junto con la concentración relativa en el sitio activo para las enzimas Ccr silvestre y su variante N81L no reactiva. Se generó un método computacional para definir los sitios de unión, que puede utilizarse como una primera aproximación a un modelo de estados de Markov. La estimación de la concentración relativa y la definición de sitios de unión fue validada relacionándola con información experimental. Los resultados obtenidos demuestran que existe una dependencia conformacional de la concentración de CO2 en el sitio activo con el estado de la subunidad. En ausencia de sustrato la mayor afinidad se encuentra en el sitio activo cerrado. La presencia de sustrato en el sitio activo cerrado invierte la afinidad sobre las subunidades del dímero, siendo la conformación abierta la que presenta una mayor afinidad en su sitio activo. La presencia de sustrato en la subunidad abierta disminuye su afinidad en un tercio sin alterar la afinidad del sitio cerrado con sustrato. Al comparar el sistema silvestre con la variante N81L, la afinidad de las subunidades no se vio modificada. Sin embargo, no se detectaron los sitios de unión del sitio activo abierto cercanos a los residuos de interés, el sustrato y el cofactor, asociados a la reacción química. Con esta información fue posible explicar la pérdida de actividad para la carboxilación de esta mutante observada experimentalmente. Los sitios de unión definidos previamente, fueron utilizados para estudiar la cinética de unión de CO2 en los pasos elementales de la catálisis y modelar la difusión de las moléculas de CO2 al sitio activo de la proteína. La conformación cerrada de la subunidad con sustrato no presentó un camino de acceso para el CO2 hacia el sitio activo. En la subunidad abierta existen sitios de unión asociados a residuos importantes para la reacción de carboxilación. Estos sitios están conservados para la conformación abierta de la subunidad sin depender de la presencia de sustrato y poseen tiempos de residencia promedio en la escala de los nanosegundos. Los tiempos de residencia en estos sitios de unión se ven modificados por la presencia de sustrato favoreciendo aquellos que facilitan la carboxilación, lo que permitiría la permanencia del CO2 unido a lo largo del cambio conformacional de cerrado del sitio activo y posterior reacción. En resumen, los resultados obtenidos en esta tesis permitieron proponer un mecanismo para la catálisis de esta enzima. En un primer paso el CO2 se une a la subunidad abierta sin sustrato. Posteriormente ocurre la unión de sustrato posicionando el CO2 para la reacción, lo que gatilla el cambio conformacional. Finalmente, se da paso a la reacción química.Este trabajo entrego una visión atómico-molecular del funcionamiento de la Ccr para la catálisis de la fijación de CO2, lo que permitirá proponer mutaciones capaces de mejorar la disponibilidad de CO2 en el sitio activo. Además, en base a los resultados obtenidos, se propuso un ciclo catalítico que permite explicar la alta eficiencia de este enzima. Para ello, cada una de las subunidades en la estructura tetramérica cumple una función distinta de manera paralela para maximizar la eficiencia de las distintas etapas del ciclo.

Carbon dioxide (CO2) is one of the most important greenhouse gases, and its accumulation in the atmosphere is associated with climate change. The fixation of this gas using enzymes for the generation of value-added organic compounds presents a current challenge in biocatalysis. Crotonyl-CoA Carboxylase-Reductase (Ccr) is one of the most efficient enzymes in CO2 fixation, showing the highest catalytic rate constant and being insensitive to the presence of oxygen, unlike RuBisCO, which is the enzyme responsible for CO2 fixation in nature. This thesis studied the conformational changes of Ccr to understand its high efficiency. Ccr is a homo-tetramer that, in the presence of NADPH and substrate analogs (substrate, carboxylation or reduction product), undergoes conformational changes, transitioning from a completely symmetric structure to a dimer of dimers configuration. Each of these dimers has an open subunit without substrate and a closed one with substrate where the reaction occurs. Its high catalytic efficiency is believed to be associated with these conformational changes leading to half site reactivity. Molecular dynamics simulations were performed to study the conformational changes of Ccr and CO2 binding. A method was developed to analyze the effect of subunit conformation on CO2 concentration at the active site, thus defining CO2 binding sites. Additionally, a procedure was developed to quantify the average residence time of CO2 molecules in the previously defined binding sites.With the combined information on conformational changes, binding, and residence of CO2 at the active site, a catalytic mechanism for the enzyme was proposed. Initially, molecular dynamics simulations were conducted to determine the equilibrium conformations of the system and possible changes in these conformations in aqueous solution. These simulations showed that the presence of the substrate, in its reactive position, maintains the closed conformation of the active site. In the absence of the substrate, the subunit undergoes an opening conformational change on the scale of tens of nanoseconds. Three residues in enoyl carboxylase-reductase (ECR) enzymes from primary metabolism (E151, N218 y N157) are conserved in Ccr. Compared to ECRs from the secondary metabolism, where these residues are not conserved, the catalytic activity is reduced, on average, 20 times. These residues are at the interface between both dimers and are far from the active site. Disrupting the interaction of these residues through point mutations in Ccr decreases its catalytic efficiency by three orders of magnitude. Principal component analysis of the mutant simulations indicates that the opening of the active site becomes slower, suggesting a direct relationship between conformational changes and catalytic efficiency. To study the effect of conformation on CO2 concentration at the active site, simulations were performed with explicit CO2 molecules in representative Ccr conformations. The distributions of CO2 molecules and their relative concentrations at the active site were analyzed for wild-type Ccr and its nonreactive variant N81L. A computational method was developed to define the binding sites, which can serve as an initial approximation to a Markov state model. The estimation of relative concentration and the definition of binding sites were validated comparing with experimental information. The results demonstrate a conformational dependence of CO2 concentration at the active site. In the absence of substrate, the highest affinity is found in the closed active site. The presence of substrate in the closed active site reverses the affinity of the subunits of the dimer, with the open conformation presenting a higher affinity at its active site. Substrate presence in the open subunit reduces its affinity by one-third without altering the closed site’s affinity with substrate. When comparing the wild-type system with the N81L variant, the subunits’ affinity remained unmodified. However, binding sites were not detected in the open active site close to the residues, the substrate and cofactor associated with the chemical reaction. This findings explained the experimentally observed loss of activity for the carboxylation of this mutant. The previously defined binding sites were used to study the kinetics of CO2 binding in the elementary steps of catalysis and model the diffusion of CO2 molecules to the protein’s active site. The closed conformation of the subunit with substrate does not present an access pathway for CO2 to reach the active site. In the open subunit, there are binding sites associated with residues important for the carboxylation reaction. These sites are conserved for the open conformation of the subunit, regardless of the substrate’s presence, and have average residence times on the nanosecond scale. The residence times in these binding sites are modified by the presence of substrate, favoring those that facilitate carboxylation, allowing CO2 to remain bound during the conformational change for closing active site and subsequent reaction. In summary, the results obtained in this thesis allowed proposing a mechanism for the enzyme’s catalysis. In the first step, CO2 binds to the open subunit without substrate. Subsequently, substrate binding occurs, positioning CO2 for the reaction and triggering the conformational change. Finally, the chemical reaction takes place. This work provides an atomic-molecular view of Ccr’s function in CO2 fixation catalysis, enabling the proposal of mutations capable of improving CO2 availability at the active site. Additionally, based on the results obtained, a catalytic cycle was proposed to explain the enzyme’s high efficiency. Each subunit in the tetrameric structure fulfills a distinct function maximizing the efficiency of the different stages of the cycle.