Aproximación al estudio de la viabilidad microbiológica del río Biobío y su relación con variables ambientales.

Abstract

Todos los cuerpos de agua existentes en el planeta tanto de agua dulce como de agua saluda, contienen o pueden contener microorganismos y dentro de los ecosistemas de agua dulce y en la microbiología del agua los grupos más significativos que podemos encontrar son: las bacterias, los virus, los hongos, las algas, y los protozoos, estos microorganismos dentro de los ecosistemas acuáticos pueden estar en suspensión en el agua o adheridos a superficies sólidas y su abundancia depende de su capacidad de supervivencia al utilizar los nutrientes disponibles. Los microorganismos acuáticos juegan un papel importante en las redes tróficas y la dinámica de los ambientes acuáticos ya que cumplen diversas funciones fundamentales para el funcionamiento de ciclos biogeoquímicos y el ecosistema. Una cuenca hidrográfica está compuesta por dos componentes: los ecosistemas terrestres que se instalan sobre las laderas de las montañas, y los ecosistemas acuáticos, los riachuelos y los ríos que drenan el agua de precipitación que no es evaporada, transpirada por un ecosistema acuático los vegetales, o percola en profundidad y alimenta los acuíferos. A una escala de tiempo histórica, el efecto de los ecosistemas terrestres sobre los acuáticos es preponderante. Las cuencas hidrográficas son sistemas integrados que entregan servicios a la sociedad y son una fuente de agua para todas las zonas ribereñas que la componen, de ahí la importancia de monitorear distintos parámetros de calidad que permitan mejorar la gestión del recurso hídrico para asegurar la salud de las personas y todos los seres vivos que la consumen. En la actualidad debido a la creciente urbanización e industrialización se han generado diversos tipos de contaminación sobre los ecosistemas acuáticos y que junto a los usos del suelo de sus cuencas hidrográficas, se ven impactados alterando las composiciones microbiológicas del agua y favoreciendo la aparición de microorganismos patógenos, es por esto que a nivel mundial sobre todo en países desarrollados existen diversas organizaciones y normativas para garantizar la calidad y seguridad del agua sin embargo, la mayoría de los países en vías de desarrollo cuentan con poca información de la calidad microbiológica considerando las variaciones temporales y espaciales que hay dentro de cuerpos de agua dulce que interfieren en la calidad microbiológica del agua como lo es en el caso de Chile, que dentro de la Norma chilena de calidad del agua (NCh 409/1) solo impone que dentro del agua para consumo que todas las muestras que se analicen deben estar exentas de Escherichia coli. Este estudio considera el Programa de Monitoreo de la Calidad del Agua del río Biobío (PMBB) que es un programa que se creó en el año 1994 por el Centro EULA-Chile y en conjunto con las principales empresas que hacen uso de la cuenca han ido monitoreando el río Biobío por más de tres décadas, información relevante para observar patrones de comportamiento y relacionarlos con los datos microbiológicos. Al respecto, se analizaron muestra de agua pertenecientes al PMBB para 19 estaciones de control correspondientes a los meses de diciembre 2021, marzo 2022 y agosto 2022, analizando variables ambientales, incorporando análisis de viabilidad microbiológica tomando como criterio la evaluación de la integridad de las membranas celulares de los microorganismos en los distintos puntos de control a lo largo del curso del río Biobío para así cuantificar los microorganismos bacterianos viables y muertos a través de densidad óptica. Para los análisis también se aplicaron técnicas de biología molecular que permitieron la extracción y cuantificación del DNA de las muestras pertenecientes a las estaciones de control del PMBB para así luego realizar reacciones en cadena de la polimerasa PCR para detectar y confirmar la presencia de bacterias y hongos en las muestras de aguas. Para establecer la relación entre datos de viabilidad y las variables ambientales, se realizó en paralelo un análisis de componentes principales (PCA) con datos históricos de los 23 parámetros fisicoquímicos que evalúa la NSCA-BB para las 19 estaciones de control pertenecientes al PMBB, para identificar patrones de comportamiento y las variables que lo explican. Esto se hizo mediante los softwares RStudio y Excel para luego correlacionar las variables fisicoquímicas con los datos de calidad microbiológica. Para los resultados del Análisis de componentes principales de interés analizado que no incluye los datos de la estación de Guaqui debido a que esta presento un comportamiento atípico, se pudieron identificar dos componentes principales: el componente principal 1 se identificó por patrones asociados a la dimensión 1 con respecto a nutrientes y estacionalidad por las variables de conductividad, fósforo total, nitrito (NO2), temperatura, AOX y cloruros, y el componente principal 2 se identificó por patrones asociados a la dimensión 2 con respecto a caudal y erosión por las variables de nitrato, hierro total, aluminio total y nitrógeno total. Para obtener una mejor interpretación del comportamiento de los patrones identificados, se generó un Biplot que superpuso el gráfico de carga e individuos (estaciones) para determinar las interpretaciones del impacto de las cargas de las variables ambientales sobre las estaciones. Respecto a los análisis de las muestras de agua del río Biobío en el laboratorio, las extracciones de ADN utilizando el protocolo inicial de extracción del kit comercial Qiagen, Kit DNeasy PowerSoil Pro, presentaron en su mayoría buenos resultados respecto a concentración y pureza del ADN extraído, sin embargo, el ADN presento fallas en su verificación de integridad a través de electroforesis. Por lo tanto, a razón de los anterior se procedió a modificar algunos pasos con respecto a la manipulación de las muestras al utilizar el protocolo de extracción de ADN del kit comercial Qiagen, Kit DNeasy PowerSoil Pro, de manera de optimizarlo y adecuarlo a la calidad de procedencia de las muestras para obtener mejores resultados de calidad del ADN extraído. Las modificaciones del protocolo inicial de extracción se generaron a través de la realización de un ensayo experimental en el laboratorio, en donde se procuró; mantener la cadena de frío a -80°C durante la manipulación de las muestras, limitar el uso de material por tubo con perlas de lisis (Power Bead Pro Tube), limitar el tiempo de lisis mecánica de las muestras a través del uso del equipo beadbeater y contemplar más solución del primer buffer de lisis (CD1) del kit de extracción. El protocolo optimizado resulto mejorar los resultados de las muestras de aguas del río Biobío que no se habían sometido a extracción de ADN con el protocolo inicial y a través de estos resultados se propuso un protocolo adecuado a la procedencia de las muestras del PMBB. A través de las modificaciones que se realizaron al protocolo inicial de extracción de ADN se destaca el hecho de proponer el cuidado de mantener la cadena de frío de las muestras pertenecientes al PMBB desde el muestreo para así poder mejorar los resultados al aplicar técnicas de biología molecular en los futuros análisis que se requieran sobre las muestras pertenecientes al programa de monitoreo del río Biobío. Al relacionar los datos de viabilidad bacteriana incluyendo las concentraciones de ADN de muestras de agua del río Biobío para las 19 estaciones de control del PMBB con los datos de los parámetros fisicoquímicos evaluados por la NSCA-BB, se pudieron generar interpretaciones finales con respecto a la correlación de variables que evidenciaron efectos toxicológicos provocados por variables fisicoquímicas que afectaron la viabilidad y la capacidad de supervivencia de las células bacterianas y (ej.: compuestos nitrogenados como NO3 y NO2) a través del análisis de componentes principales se logró identificar patrones de comportamiento que respaldan que los resultados de los efectos toxicológicos identificados y que son consistentes con estudios previos donde los cambios estacionales y espaciales en las variables ambientales tienen un efecto significativo en la viabilidad de la comunidad microbiana. De manera más específica se lograron identificar los efectos que suceden con respecto a los compuestos nitrogenados, fosforo y hierro, frente a los recuentos de viabilidad. Las bacterias nitrificantes regulan los efectos y los riesgos de eutrofización, que pueden tener la entrada del N alóctonos en los ecosistemas acuáticos meso-oligotróficos, ya que, mediante su metabolismo, consumen las formas inorgánicas y contribuyen al equilibrio del ciclo biogeoquímico (Xia et al. 2004; French et al. 2012). Sin embargo, de los resultados se pudo observar como el exceso de cantidad de compuestos nitrogenados como nitrato (NO3) y nitrito (NO2) en el ecosistema acuático afecta la viabilidad de los microorganismos presentes en el agua. La alta presencia de nitrito en el agua tiene efectos tóxicos sobre los microorganismos en el sistema, inhibiendo la actividad celular y afectando la eficiencia de eliminación de nitrógeno y fósforo (Wang et al., 2019a; Zekker et al., 2021) e investigadores han considerado que un alto contenido de nitrito tiene un impacto tóxico en las células microbianas, interrumpiendo la desnitrificación y la eliminación de fósforo e incluso provocando la ruptura de las células microbianas y la liberación de polifosfato (poli-P) (Rey-Martínez et al., 2021; Zeng et al., 2014). Respecto a la presencia de nitrato se observó en los gráficos de dispersión su alta presencia produce que existan más células muertas que vivas, y es que el exceso de nitratos en el agua genera una serie de problemas para el entorno y la biodiversidad de la zona afectada por esta contaminación, agotando la cantidad de oxígeno disponible en el agua ocasionando la muerte de la vida acuática, aumento de la turbidez, aumento del grado de sedimentación y también afecta a las características organolépticas del agua, tales como olor, color, sabor. Con respecto a el fósforo se observó un efecto positivo respecto al crecimiento bacteriano ya que a medida que aumenta la presencia de fósforo en el agua aumentaba la cantidad de células bacterianas. El fósforo actúa como un sustrato clave para la viabilidad de las células bacterianas, a mayor cantidad de fósforo aumentara a la vez la cantidad de células bacterianas totales debido a que es fundamental para la supervivencia de las bacterias, debido a que es esencial en la generación de energía (ATP) y es un componente químico importante de los ácidos nucleicos, azúcares, ácidos orgánicos y lípidos. Sin embargo, se mención que un exceso de fósforo y en sus formas como ortofosfato provocan el crecimiento excesivo de algas las que rápidamente provocan un deterioro en la calidad del agua, produciendo un desequilibrio en la vida acuática conocido como eutrofización, provocando menor disponibilidad de oxígeno para organismos como peces y crustáceos, reduciendo así la biodiversidad y aumentando la sedimentación (Haygarth y col., 2005; Gerardi, 2006). Otro efecto que se identifico fue la correlación positiva existente entre Hierro y Concentraciones de ADN, esto se explica debido a que este metal es esencial para el metabolismo celular como cofactor numerosas enzimas (Wandersman y Delepelaire, 2004), además de cumplir diversas funciones en procesos biológicos esenciales, como transporte de oxígeno, síntesis de ADN, fijación de nitrógeno, respiración y fotosíntesis (Greenshields et al., 2007).