Estudio del cultivo y concentración de una cepa Lactobacillus plantarum autóctona empleando un reactor y membranas semipermeables Secado y estabilización de biomasa

Abstract

fin de formular un producto probiótico deshidratado estable en base a una cepa autóctona Lactobacillus plantarum, con miras a su uso profiláctico en la industria salmonera, se planteó un esquema productivo que contaba con las etapas de cultivo, concentración por membranas y estabilización de biomasa mediante secado por atomización. Para cada una de las etapas antes descritas se estudiaron las variables, que de acuerdo a literatura, tenían una mayor incidencia en la eficiencia de la operación, entendiendo por eficiencia, no sólo el rendimiento o la productividad, si no también el recuento de microorganismos viables presentes. Fue así como para la etapa de cultivo se consideró el modo de operación: batch, fedbatch, continuo, y dentro de estos el control de pH, la estrategia de alimentación y el factor de dilución respectivamente. En la concentración por membranas se evaluó el efecto de la presión transmembrana, la velocidad tangencial, el pH de la alimentación y la concentración de sólidos, para esta parte del proceso también debió considerarse el ensuciamiento de la membrana, lo cual claramente afectaría el proceso productivo. Finalmente, para el secado por atomización se partió por estudiar las variables de operación como presión de atomización, temperatura de salida y concentración de sólidos en la alimentación, para seguir con los efectos de estrés térmico, salino y ácido en la resistencia de los microorganismos, luego, se evaluó el potencial de diversas sustancias y mezclas de ellas para su uso en la microencapsulación mediante el secado por atomización. En esta última etapa se consideró además el periodo de almacenamiento de los productos deshidratados, estabilidad que se midió a 4, 25 y 37°C. De los ensayos en modo discontinuo se encontró que la cepa Lactobacillus plantarum LPS47presentaba una alta tolerancia a ambientes ácidos, lo cual le permitió alcanzar una viabilidad del orden de ~109 UFC/ml independiente si el cultivo se hizo o no con control de pH. En este sentido, lo único que se vio afectado fue la producción de ácido láctico, que pasó de una concentración de 4 g/L (sin control de pH) a 15 g/L en cultivos con control de pH. Los ensayos en modo fed-batch revelaron que dependiendo del sustrato y de la estrategia de la alimentación fue posible fomentar la producción de biomasa o de ácido láctico, fue así como alimentando en forma continua (0.17 ml/min) una mezcla de lactosuero – peptona de caseína se logró una concentración final de 40 g/L de ácido láctico, por otro lado, usando el mismo sustrato pero alimentado en forma intermitente fue posible lograr un aumento en el recuento de microorganismos viables de más de 10 veces con respecto a lo que se tenía al finalizar el cultivo en modo discontinuo. En el caso del cultivo continuo, L. plantarum fue capaz de adaptar su tasa de crecimiento a todos los tiempos de residencia ensayados (entre 4 y 12 horas), la productividad volumétrica de biomasa por su parte fue entre 2 a 6 veces superior a lo que se había encontrado en modo discontinuo, sin embargo, ni la concentración de ácido láctico ni el recuento de microorganismos viables fueron atractivos en comparación a lo que se había encontrado operando en modo fed batch o discontinuo. Fue así, como al finalizar esta etapa y dado el conocimiento cabal que se tenía de la operación, se decidió seguir trabajando en modo discontinuo sin control de pH, sin embargo, se dejó la puerta abierta, para el cultivo fedbatch en pos de seguir investigando su aplicación especialmente en cepas que pudieran ser más restrictivas en términos nutricionales o más delicadas frente a condiciones adversas del medio (e.g. acidez). Con respecto a la operación de microfiltración, se encontró que los mejores resultados se lograban operando la membrana a una presión transmembrana de 2 bar y a una velocidad tangencial de 4 m/s, sin necesidad de alterar el pH del medio de cultivo (~3.8). Bajo las condiciones anteriormente descritas, fue posible aumentar el recuento de bacterias viables en 2.5 veces, ahora bien, la variable que más afectó fue la presencia de peptona de caseína en el medio de cultivo, de hecho, al eliminar este componente se logró aumentar el recuento hasta 4 veces en el concentrado en relación a la alimentación, sin embargo, al no contar el medio de cultivo con este aditivo la concentración bacteriana no alcanzó a llegar a 108 UFC/ml, por tanto no resultaba adecuado para la aplicación que se esperaba darle al producto final. Ahora bien, para esta cepa en particular, se encontró que la separación de la biomasa desde el caldo de fermentación no era realmente necesaria dado que la misma se comportaba de buena forma en los pasos siguientes aún en presencia de los metabolitos, sin embargo, el uso de la microfiltración pudiera ser necesaria e incluso mandataria dependiendo del microorganismo con el cual se esté trabajando. Para finalizar, el secado por atomización fue optimizado en términos de sus variables de operación encontrándose que lo más adecuado en términos de rendimiento (> 40%), humedad (<10%) y pérdida de viabilidad (< 1 ciclo log) era trabajar con una presión de atomización de 2 bar, una concentración de sólidos de 20%p/p y una temperatura de salida de 70°C, siendo esta última, la variable de operación que más afectó la sobrevida de los microorganismos. En la medida que las bacterias fueron cultivadas durante la fase estacionaria de crecimiento, el estrés osmótico no le confirió resistencia adicional durante el secado, no así, el estrés térmico, ya que se comprobó que aumentando la temperatura de cultivo de 25°C a 32°C la pérdida de viabilidad disminuía de 3 a 1.5 ciclos logarítmicos. En forma adicional, el uso de microencapsulación fue positivo y necesario en todos los aspectos, encontrándose que la mezcla de proteína de suero – glutamato monosódico – sacarosa – sorbitol era capaz de lograr que la pérdida de viabilidad durante la operación fuera incluso de 0.3 ciclos logarítmicos, de la misma forma el uso de esta mezcla protectora permitió mantener la viabilidad durante el almacenamiento a 25°C en atmósfera no controlada durante 30 semanas antes de alcanzar la concentración límite de 107 UFC/g. Una vez obtenido el producto final, se sometió a una serie de pruebas para confirmar la mantención de sus características probióticas, a partir de estos ensayos se encontró que el microorganismo mantenía las mismas propiedades que la cepa fresca en términos de crecimiento, capacidad acidificante y poder de inhibición frente a patógenos (en este caso Yersinia ruckeri). Para finalizar entonces, se procedió a hacer pruebas a mayor escala, encontrándose que la producción fue satisfactoria tanto a escala piloto (cultivo de 20 L) como a nivel semi – industrial (120 L) llegando a obtener una concentración de microorganismos del orden de 1010 UFC/g. En conclusión, se ha demostrado la factibilidad técnica y económica de obtener un producto probiótico deshidratado estable mediante la operación conjunta de cultivo en modo discontinuo sin control de pH y secado por atomización en presencia de una mezcla de proteína de suero/glutamato/sacarosa/sorbitol al 20%p/p en proporción 17:1:1:1. El producto fue capaz de mantener una viabilidad comercialmente adecuada (> 107 UFC/g) por al menos 7 meses a 25°C en un ambiente sin control de humedad. En conjunto con esto, las pruebas realizadas post – secado mostraron que la cepa deshidratada fue capaz de mantener las características de interés tecnológico, que presentaba la cepa fresca, inalteradas.