Estudio de la función de Ric-8A y Gα13 durante la migración de las células de la cresta neural craneal en Xenopus.

Abstract

RIC-8 es una proteína accesoria de la señalización de la proteína G heterotrimérica la cual tiene actividad GEF y de chaperona sobre distintas subunidades Gα. Ric-8A posee un patrón de expresión neuroespecífico durante la embriogénesis de ratón y es requerido para el desarrollo temprano de este organismo, ya que embriones “knock-out” para Ric-8A mueren en estadios de gástrula. Este fenotipo letal limita seriamente la compresión de la función de Ric-8A durante la embriogénesis y sugiere que los modelos no-mamíferos vertebrados pueden abordar de mejor manera este problema. Por otro lado, la proteína G heterotrimérica ha sido descrita participando en la migración celular en distintos tipos celulares, incluyendo a los movimientos ocurridos durante la gastrulación en el desarrollo embrionario de diferentes modelos, donde recientemente se ha vinculado a Ric-8A en estos eventos. En nuestro laboratorio hemos descrito una nueva función para Ric-8A durante la migración celular en Xenopus, donde experimentos de pérdida de función resultan en defectos en la correcta formación de los cartílagos faciales. En esta tesis, hemos realizado ensayos de epistasis demostrando que Ric-8A actúa rio arriba de la señalización de Gα13,y controlan la migración de la células de la cresta neural craneal. Explantes de cresta neural fueron analizados in vivo a través de “time-lapse” y de inmunocitoquímicas para evaluar la dispersión, la estabilidad de las protrusiones y la localización subcelular de diversas proteínas. El silenciamiento de Gα13 produce el mismo fenotipo que las células morfantes para Ric- 8A: Las células presentan una alteración en el citoesqueleto de actina, muestran protrusiones inestables en el tiempo y una fuerte reducción en el número y la dinámica de las adhesiones focales. Además, la sobreexpresión de la subunidad Gα13, es suficiente para rescatar todos los fenotipos morfantes observados para Ric-8A. También demostramos que, Ric-8A y Gα13 interaccionan y colocalizan principalmente en las protrusiones del frente de migración y en menor proporción en el área citoplasmática. Por otro lado, la quinasa de adhesiones focales (FAK) colocaliza parcialmente con Gα13 endógena y ambas proteínas a través de ensayos de inmunoprecipitacion determinamos que forman parte del mismo complejo proteico. Además Src constitutivamente activa, proteína que cumple una función importante en la formación de las adhesiones focales, es capaz de rescatar el fenotipo morfante de Gα13 en las crestas neurales. Finalmente, el silenciamiento de Ric-8A y Gα13 induce una alteración en la localización del marcador de polaridad aPKC y provoca defectos en la respuesta quimiotáctica hacia Sdf-1. Por lo tanto, con este trabajo de tesis comenzamos a revelar parte de los mecanismos moleculares esenciales para la migración colectiva, evento importante durante la embriogénesis, y que en este caso involucran la regulación de la vía de proteínas G heterotriméricas y a su GEF Ric-8A. Proponemos que, Ric-8A regula la señalización de Gα13, y en conjunto, controlan la polaridad celular y la morfología celular, regulando las propiedades de las adhesiones focales y la formación de protrusiones, requeridas para un apropiada migración celular.