Evaluación de las propiedades funcionales y bioquímicas de los residuos KK385-386 del receptor de glicina α 1 en la modulación por etanol en el sistema nervioso central de ratones transgénicos.

Abstract

Estudios previos en nuestro laboratorio han demostrado que la corriente de cloruro (Cl-) activada por glicina puede ser potenciada por concentraciones bajas y clínicamente relevantes de etanol. Además, se ha demostrado la modulación intracelular mediada por el dímero GβУ de la proteína G sobre el Receptor de Glicina (R-Gli) α1, mediante la interacción con los aminoácidos básicos (316-320 y 385/386) localizados en el loop intracelular TM3-TM4. R-Gli α1 mutado en los residuos 316-320 y 385-386, son resistentes a la modulación del dímero GβУ y también insensibles a los efectos de etanol. Además, datos recientes han demostrado que R-Gli sería importante en el sistema de recompensa del cerebro (Área Tegmental Ventral; VTA, Corteza prefrontal; PFC y núcleo accumbens; nAc). Es por ello, que se ha generado un ratón Knock-In (KI) para R-Gli α1, el cual posee mutaciones KK385-386AA, generándose un animal KI KK385/386AA. En esta tesis, evaluamos las propiedades de los receptores expresados in situ en neuronas de animales WT y KI de regiones involucradas con el sistema mesolímbico dopaminérgico (nAc, PFC y VTA). Primero, caracterizamos bioquímicamente (PCR, western blot e inmunocitoquímica) la presencia de mRNA y proteínas pre y post sinápticas importantes para el balance excitatorio-inhibitorio. Encontramos, que no existen grandes diferencias en la expresión de proteínas en regiones del sistema nervioso central (SNC) de WT y KI, sólo se muestra un incremento en las proteínas pre sinápticas GAD67 y vGLUT en el cerebelo del ratón KI, que están relacionadas con la síntesis de GABA y transporte de glutamato, respectivamente. Luego, a través de estudios electrofisiológicos en neuronas disociadas de nAc, evaluamos y comparamos funcionalmente la modulación por etanol entre neuronas de ratones WT y KI en nAc. Encontramos que las neuronas accumbales KI son menos sensibles a los efectos de etanol mediados por GβУ . Además, utilizando el animal D1-GFP, comparamos la sensibilidad a etanol entre Medium Spiny Neurons (MSNs) D1+ y D1-, encontrando que las MSNs D1+, son sensibles a bajas concentraciones de etanol (1, 5 y 10 mM), mientras que las D1-, son sensibles a altas concentraciones (50, 100 mM). Posteriormente, utilizando rebanadas de nAc, determinamos la presencia de R-Gli no-sinápticos y sinápticos que median corrientes tónicas y fásicas, respectivamente. Encontramos, que MSNs poseen corrientes tónicas y fásicas, siendo sólo las primeras sensibles a bajas concentraciones de etanol, mientras que las segundas son insensibles. Sugiriendo que R-Gli no-sinápticos sensibles a etanol, estarían participando en el balance excitatorio-inhibitorio del nAc, debido a que etanol disminuyen los potenciales de acción (AP) sólo en MSNs WT, siendo este efecto bloqueado por estricnina (STN). Finalmente, con estudios de comportamiento, encontramos que ratones KI fueron similares a WT en condiciones controles, pero cuando se desarrolló la prueba de Perdida del reflejo de enderezarse (LORR), ratones KI mostraron un menor tiempo de sedación a concentraciones altas de etanol (3.5 g/kg). Además, animales KI mostraron mayor consumo y preferencia a etanol. En conclusión, esta tesis nos ayuda a entender el rol de R-Gli α1 en el sistema de recompensa, con el fin de analizar la acción fisiológica de etanol en el desarrollo patológico del abuso alcohólico y alcoholismo.