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Título : Estudio de los mecanismos moleculares involucrados en la maduración y mantención del aparato postsináptico de la UNM de vertebrados mediados por el receptor FzD9.
Autor : Henríquez Hohmann, Juan Pablo; supervisor de grado
Ojeda Orellana, Jorge Alfredo
Palabras clave : Sistema Nervioso - Vertebrados;Neurotransmisores - Vertebrados;Transmisión Nerviosa
Fecha de publicación : 2017
Editorial : Universidad de Concepción.
Resumen : El establecimiento de contactos entre las neuronas y sus células blanco es esencial para el correcto funcionamiento del sistema nervioso. Este proceso gradual es coordinado principalmente por moléculas secretadas desde los componentes pre y postsinápticos para la formación, establecimiento, maduración y mantención de las sinapsis. Un modelo arquetípico de sinapsis es la Unión Neuromuscular (UNM) de vertebrado, una sinapsis periférica donde el neurotransmisor acetilcolina (ACh) es liberado desde el terminal presináptico, constituido por el axón motor, y se une a receptores de acetilcolina (AChR) que se encuentran agregados en la especialización postsináptica de la fibra muscular. La sinapsis neuromuscular presenta un alto grado de organización subcelular, además de gran tamaño y fácil accesibilidad experimental, lo que ha permitido el entendimiento de principios generales de la sinaptogénesis, de la función neurofisiológica y al desarrollo potencial de terapias para desórdenes musculares. Durante el desarrollo embrionario, la diferenciación presináptica se acompaña de cambios en las terminales del motor que entran en contacto con las fibras musculares, mientras que la diferenciación postsináptica se caracteriza por la formación de agregados del receptor de acetilcolina (AChR) en la membrana muscular. Dos moléculas presinápticas controlan la diferenciación postsináptica temprana: agrina, a través de su unión al receptor MuSK estabiliza a los agregados del AChR, mientras acetilcolina (ACh) a través de una vía que involucra a la quinasa dependiente de ciclina 5 (Cdk5), los dispersa. Luego, en la fase postnatal, el proceso de maduración es evidenciado en los cambios morfológicos postsinápticos en los que pequeñas densidades uniformes de AChR en forma de placa ovalada son transformadas en estructuras multiperforadas grandes y elaboradas con forma de pretzel. Las diferentes morfologías visualizadas en la transición de placa a pretzel se han utilizado como un parámetro cuantitativo de maduración. Sin embargo, a pesar de una morfología bien descrita, las moléculas y los mecanismos que regulan el proceso de maduración y mantenimiento de la UNM no han sido del todo descritos. Creciente evidencia revela que las vías Wnt regulan aspectos claves de la sinaptogénesis durante el desarrollo de la UNM. En mamíferos, 19 ligandos Wnt se unen a 10 posibles receptores Fzd activando, al menos, tres vías: en la vía canónica, la unión de un ligando Wnt al receptor Fzd requiere que los co‐receptores LRP5 / 6 induzcan la acumulación citosólica de ‐catenina y su translocación nuclear para activar genes blanco. Esta vía puede ser inhibida por las proteínas DKK, que actúan a través de co‐receptores LRP5 / 6. Dos vías no canónicas son activadas por Wnts: la vía de polaridad celular en el plano (PCP) y las vías Wnt/Ca2+, activando diferentes efectores intracelulares. Evidencia relevante muestra que las diversas vías Wnt controlan el ensamblaje embrionario de la UNM a) induciendo la agregación aneural temprana de AChRs en la membrana del músculo, b) estabilizando los agregados de AChRs en la región sináptica, y dispersando los agregados de AChR en regiones extrasinápticas. En este trabajo, hemos abordado experimentalmente la posibilidad de que receptores Fzd podrían estar involucrados en la generación de estas diferentes respuestas. Previamente hemos mostrado que Fzd9 se distribuye junto con los agregados de AChR en UNMs de estadio embrionario y que, en cultivo de células C2C12 diferenciadas a miotubos tratados con agrina, Fzd9 disminuye la agregación de AChRs comparado con el control. A su vez, el silenciamiento de Fzd9 induce un mayor número de agregados de AChR. Basados en estos hallazgos y los trabajos anteriores, se abordó la hipótesis “Fzd9 promueve la maduración del aparato post sináptico de la UNM de vertebrados a través de una vía Wnt dependiente de β‐catenina”. Dada la similitud del efecto desagregante de Fzd9 con la vía activada por ACh/Cdk5 en etapas embrionarias, la hipótesis secundaria derivada de la hipótesis principal es que “los mecanismos moleculares activados por el receptor Fzd9 involucran además la participación de efectores moleculares de la vía de señalización ACh/Cdk5”. En esta tesis, la aproximación in vivo fue desarrollada en UNMs de músculo Levator auris longus (LAL) donde se estandarizó la detección endógena y el análisis de proteínas distribuidas en los componentes pre y postsinápticos en condiciones de modulación de proteínas a través de electroporación de alta eficiencia de fibras musculares, que fueron combinados con ensayos de inmunofluorescencia y de neurotransmisión muscular mediante registro electrofisiológico intracelular de preparados ex vivo de músculo LAL. Se evaluó la posible función desagregante de AChRs de la vía ACh/Cdk5 en etapas postnatales mediante su activación por sobre‐expresión de Cdk5 muscular, lo que indicó que Cdk5 promueve la fragmentación del aparato postsináptico. En el estudio de los efectores de la vía Wnt en la UNM, se analizaron los cambios morfológicos postsinápticos, además del acoplamiento Excitación‐Contracción (E‐C). A su vez, mediante microscopía confocal se analizó tanto la localización de proteínas Wnt como su distribución en UNM inervadas y denervadas mediante la resección de un segmento del nervio facial. Los resultados muestran que Fzd9 se distribuye junto con los agregados del AChR durante el desarrollo postnatal co‐localizando con los componentes pre y postsinápticos de la UNM. Teniendo en cuenta la localización postsináptica de Fzd9, analizamos su posible función a través de la ganancia y pérdida de expresión de Fzd9 por electroporación. Los resultados indicaron que la sobreexpresión de Fzd9 aumenta la complejidad del aparato postsináptico probablemente reorganizando los agregados de AChRs. A su vez, el silenciamiento de Fzd9 promueve la aparición de estructuras postsinápticas fragmentadas. Adicionalmente, la sobreexpresión de Wnt3a en ratones adultos también induce la morfología fragmentada, un fenotipo similar a los aparatos postsinápticos descritos en envejecimiento. Los efectores de la vía de señalización Wnt / ‐catenina mostraron resultados comparables. Para entender la relevancia de los cambios morfológicos del aparato postsináptico en términos funcionales, se realizaron registros intracelulares de fibras musculares mediante la estimulación presináptica de preparados ex vivo del músculo LAL. Luego de estimulación a alta frecuencia, encontramos que la sobre‐expresión o silenciamiento de Fzd9 no afectó la liberación de neurotransmisor desde el terminal presináptico en P21. Sin embargo, se observó que las amplitudes de los pulsos evocados estaban disminuidas cuando Fzd9 era sobre‐expresado. A baja frecuencia de estimulación, el registro intracelular de fibras electroporadas con Fzd9 muestra una disminución significativa del tamaño del potencial de placa terminal evocado (EPP) y de la liberación espontánea de neurotransmisor (mEPP). Estos análisis se correlacionaron con una disminución en la resistencia de entrada de membrana, lo que sugiere que el receptor postsináptico Fzd9 está involucrado en la transmisión sináptica. En forma sorprendente, se observó que la fragmentación del aparato postsináptico inducida por Wnt3a se acompañó de transmisión neuromuscular más eficiente. Finalmente, analizamos la relación pre y postsináptica donde en los ratones electroporados para sobre‐expresar o silenciar Fzd9, se observó una pérdida de la precisión en el alineamiento de los AChRs postsinápticos con los terminales presinápticos. En forma similar, cuando se sobre‐expresó Wnt3a en etapa adulta, se encontró una disminución en la yuxtaposición del terminal presináptico en relación a los AChRs en la membrana muscular. En conjunto, concluimos que Fzd9 y efectores de la vía Wnt dependiente de ‐catenina podrían afectar la organización postsináptica para el ensamblaje de UNMs funcionales, modulando la distribución postsináptica de los agregados de AChRs.
Descripción : Tesis para optar al grado de Doctor en Ciencias Biológicas. Área Biología Celular y Molecular.
URI : http://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/2527
Aparece en las colecciones: Ciencias Biológicas - Tesis Doctorado

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