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Título : Neuroprotective effects evaluation of a recombinant human low-glycosylation erythropoietin isoform.
Otros títulos : Evaluación del efecto neuroprotector de una isoforma de eritropoyetina humana recombinante de bajo nivel de glicosilación.
Autor : Toledo Alonso, Jorge Roberto; supervisor de grado
Castillo Hernández, Carolina Angélica
Palabras clave : Eritropoyetina;Glucosilación;Agentes Neuroprotectores;Sustancias Protectoras;Enfermedades Neurodegenerativas - Terapia
Fecha de publicación : 2018
Editorial : Universidad de Concepción.
Resumen : Erythropoietin (Epo) is a glycoprotein hormone that mainly regulates hematopoiesis, has a molecular weight of approximately 34 KDa and is made up of 165 amino acids, it has potential N- and Oglycosylation sites at residues Asn 24, 38, 83 and Ser 126 respectively. Its tetra-antennary and tetra-sialylated glycosylation pattern is specifically related to its affinity for its receptor and directly related to its half-life in circulation. Epo exerts its effect by binding to its receptor (EpoR), which belongs to the type I cytokine receptor superfamily, weighs approximately 66 KDa, and binds to its ligand forming homodimers on the cell surface. This interaction amplifies a signaling cascade, primarily through STAT5, PI3K, MAPK, and PKC, resulting in positive regulation of anti-apoptotic Bcl-2 family proteins, such as Bcl-xL. Furthermore, the presence of the Epo receptor in non-erythroid tissues, such as the central nervous system (CNS), suggests a production of the hormone in these tissues, with a relevant role in the protection against cellular stress, preventing apoptosis through the activation of its receptor and the previously mentioned pathways. The clinical use of Epo depends on its recombinant production, which is developed in mammalian cell culture expression systems as bioreactors, being commonly used Chinese hamster ovary cells, The main disadvantage of this system is its low efficiency and high production cost. As an alternative to this expression system, the Biotechnology and Biopharmaceuticals Laboratory has developed a new method for the production of recombinant human erythropoietin, which consists of a system of direct transduction of goat mammary gland with adenoviral vectors containing the human erythropoietin gene information. This system allows the efficient production of the desired recombinant protein, generating a variant of Epo with a bi-antennary glycosylation pattern and lacking sialic acid, which has a direct effect on the decrease of its hematopoietic activity (EpoL). Therefore, the present project focused on studying the EpoL/EpoR interaction in the CNS and its neuroprotective effects, mediated by a recombinant Epo variant with a bi-antennary and asialylated glycosylation pattern, against chronic oxidative stress models. Specifically, the aim of the project was to evaluate and molecularly characterize the neuroprotective capacity of EpoL, comparing it with native Epo. From the results we can point out that this variant, has a neuroprotective effect mediated by EpoR activation, increasing intracellular signaling of anti-apoptotic pathways, decreasing local oxidative stress and improving the synaptic parameters evaluated. All these effects were obtained at a concentration ten times lower than with native Epo and without altering hematocrit, which leads us to suggest the potential use of EpoL as a biopharmaceutical for the study and treatment of CNS-related diseases with an inflammatory and oxidative stress component such as cerebrovascular infarction or neurodegenerative diseases.
Descripción : Tesis para optar al grado de Doctor en Ciencias Biológicas Área Biología Celular y Molecular.
La eritropoyetina (Epo) es una hormona glicoproteica que regula principalmente la hematopoyesis, posee un peso molecular de 34 KDa aproximadamente y está conformada por 165 aminoácidos, posee sitios potenciales de N- y Oglicosilaciones en los residuos Asn 24, 38, 83 y Ser 126 respectivamente. Su patrón de glicosilación tetra-antenario y tetra-sialilado se relaciona específicamente con la afinidad por su receptor y directamente con su vida media en circulación. Epo ejerce su efecto mediante la unión a su receptor (EpoR), que pertenece a la superfamilia de receptores de citoquina tipo I, pesa de 66 KDa aproximadamente, y se une a su ligando formando homodímeros en la superficie celular. Esta interacción amplifica una cascada de señalización, principalmente a través de STAT5, PI3K, MAPK, y PKC, lo que da lugar a una regulación positiva de proteínas antiapoptóticas de la familia Bcl-2, como Bcl-xL. Además, la presencia del receptor de Epo en tejidos no eritroides, como en el sistema nervioso central (SNC), sugiere una producción de la hormona en estos tejidos, con una función relevante en la protección ante estrés celular, evitando la apoptosis mediante la activación de su receptor y las vías anteriormente señaladas. El uso clínico de Epo depende de su producción recombinante, que se desarrolla en sistemas de expresión de cultivos celulares de mamífero como biorreactores, siendo comúnmente utilizadas las células de ovario de hámster chino, lo que tiene como principal desventaja la baja eficiencia y el alto costo productivo. Alternativamente a este sistema de expresión, el Laboratorio de Biotecnología y Biofármacos ha desarrollado un nuevo método para la producción de eritropoyetina recombinante humana, que consiste en un sistema de transducción directa de la glándula mamaria de cabra con vectores adenovirales que contienen la información génica de eritropoyetina humana. Este sistema permite producir eficientemente la proteína recombinante deseada, generando una variante de Epo con un patrón de glicosilación bi-antenario y carente de ácido siálico, lo que tiene un efecto directo en la disminución de su actividad hematopoyética (EpoL). Por tanto, el presente proyecto se enfocó en estudiar la interacción EpoL/EpoR en el SNC y sus efectos neuroprotectores, mediados por una variante de Epo recombinante con un patrón de glicosilación bi-antenario y asialilado, frente a modelos de estrés oxidativo crónico. Específicamente, el objetivo del proyecto fue evaluar y caracterizar molecularmente la capacidad neuroprotectora de EpoL, comparándola con Epo nativa. De los resultados podemos señalar que esta variante, tiene un efecto neuroprotector mediado por la activación del EpoR, aumentando la señalización intracelular de vías anti-apoptóticas, disminuyendo el estrés oxidativo local y mejorando los parámetros sinápticos evaluados. Todos estos efectos se obtuvieron a una concentración diez veces menor que con Epo nativa y sin alterar el hematocrito, lo que nos lleva a sugerir el potencial uso de la EpoL como un biofármaco para el estudio y tratamiento de enfermedades relacionadas al SNC con un componente inflamatorio y de estrés oxidativo como el infarto cerebrovascular o enfermedades neurodegenerativas.
URI : http://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/2981
metadata.dc.identifier.other: 237030
Aparece en las colecciones: Departamento Biología Celular y Molecular - Tesis Doctorado

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