Purificación y caracterización in vitro de proteína anticongelante con actividad crioprotectora proveniente de la Cepa UDEC-P9.

Abstract

La síntesis de proteínas anticongelantes (AFPs) en los organismos vivos es una de las estrategias de sobrevivencia al daño que produce el congelamiento y descongelamiento (C/D). Estas proteínas presentan alta diversidad estructural, que se ha relacionado con sus propiedades funcionales, consistentes en la unión al hielo en formación y la inhibición de su crecimiento. Dos propiedades funcionales de importancia de las AFP son la histéresis termal (HT) y la inhibición de la recristalización (IR). La HT consiste en la disminución del punto de congelamiento del agua sin alterar el punto de fusión; en tanto, la IR consiste en la inhibición del proceso de unión de cristales de hielo durante el descongelamiento. El objetivo de esta tesis fue determinar si la purificación de la AFP UDEC-P9, producida por una cepa previamente aislada, altera sus propiedades funcionales (efecto crioprotector e IR) in vitro. Inicialmente, se trabajó con 2 cepas patagónicas (UDEC-P4 y UDEC-P9) además de 5 cepas ensayadas en trabajo paralelo (Patagónicas: UDEC-P7, UDEC-P11, RIO-6P; Antárticas: UDEC-A5, UDEC-A8). También, se incluyeron las cepas Escherichia coli BL21-AFP (control positivo) y las cepas E. coli BL21 y E. coli ATCC25922 (controles negativos). Todas las cepas se incubaron a 25°C, se indujeron a 4°C por 72 h y se sometieron a ruptura por ultrasonido. El extracto citosólico soluble (ECS) se obtuvo por centrifugación a 12.000g por 30 minutos. Los resultados muestran que los ECS de las cepas UDEC-A5 y UDEC-P11 no tienen capacidad crioprotectora; las otras, solo el ECS de la cepa UDEC-P9 dio positivo a todos los ensayos. La AFP purificada presentó peso molecular 67.000 y mantuvo su actividad crioprotectora en nano partículas de oro, pero perdió esta capacidad por tratamiento con proteasa. El calentamiento a ebullición afectó parcialmente su actividad. El análisis global de los resultados permite aceptar la hipótesis planteada y sugiere la presencia de una AFP con potencial uso biotecnológico, por sus peculiares características. Actualmente se han iniciado estudios tendientes a detectar su codificación genética y su clonación para ser sobre-producida in vitro.