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Title: Microbiota bacteriana asociada a conducto radicular con diagnóstico de periodontitis apical crónica persistente y rol de nanopartículas de cobre como nuevo antimicrobiano endodóntico
Authors: Bello Toledo, Helia , supervisora de grado
Sánchez Sanhueza, Gabriela
Keywords: Patología Bucal;Periodontitis;Absceso Periapical;Enfermedades Periodontales - Tratamiento
Issue Date: 2018
Publisher: Universidad de Concepción. Facultad de Ciencias Biológicas, Departamento de Microbiología
Abstract: A nivel mundial se describe una alta prevalencia de periodontitis apical crónica persistente en dientes obturados con lesión apical, asociada a persistencia bacteriana, que va desde 40 % a 61 %. En Chile, la frecuencia de fracasos de tratamientos endodónticos, se informa en 55 %;sin embargo, estos resultados se basan sólo en parámetros clínicos, sin ninguna evidencia microbiológica. Los protocolos de medicación utilizados en endodoncia en Chile se basan en formulaciones diseñadas y utilizadas en el extranjero, para otras poblaciones del mundo. Las bacterias aisladas de conductos radiculares pueden establecerse en biopelículas intraconducto en los túbulos dentinarios, y la captación y penetración de los agentes antimicrobianos en ellos son elementos que hay que tener en consideración en los resultados terapéuticos. Las nanopartículas metálicas son potencialmente útiles dentro de este contexto, ya que por sus características físico-químicas podrían penetrar en la biopelícula, actuando como antimicrobianos a una concentración muy pequeña. El objetivo de esta tesis fue determinar la composición de la microbiota bacteriana asociada a conductos radiculares con diagnóstico deperiodontitis apical crónica persistente y evaluar el rol de nanopartículas de cobre (NPCu) como un nuevo agente antimicrobiano intraconducto. De un universo de 250 piezas dentarias diagnosticadas con periodontitis apical crónica persistente en el periodo de julio a noviembre de 2015, se obtuvo 24 muestras desde pacientes que cumplieron con los criterios de inclusión del estudio. Las características clínicas más relevantes fueron registradas. Se procedió a extraer el ADN bacteriano y a amplificar las regiones variables V3 y V4 del gen ARNr 16S. El producto de amplificación fue secuenciado mediante Illumina MiSeq System. Posteriormente se procesaron los datos utilizando la aplicación bioinformática Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME). Las lecturas no quiméricas representativas se agruparon en unidades taxonómicas operacionales (OTUs) utilizando un umbral de identidad de 97% y se clasificaron taxonómicamente mediante coincidencias con secuencias en la base de datos Greengenes (versión gg_13_5). El porcentaje de cobertura se estimó mediante el método estimador de cobertura no paramétrico de Good; Alfa diversidad se evaluó con un estimador de riqueza Chao1; y el índice de diversidad de Shannon se calculó a través de la herramienta bioinformática Mothur. Las estructuras de comunidades microbianas en diferentes muestras se compararon utilizando UniFrac basado en la relación filogenética de lecturas representativas de diferentes muestras, y las distancias UniFrac ponderadas se utilizaron para construir un análisis de coordenadas principales. Desde todas las muestras se aislaron e identificaron las especies prevalentes cultivables a través de sistemas bioquímicos como API® Rapid ID 32 A (BioMerieux, Marcy-l’Etoile, Francia) y API® 20E (BioMerieux, Marcy-l’Etoile, Francia). Finalmente, se corroboró la identificacion de cada especie bacteriana mediante secuenciación del producto de amplificación con reacción en cadena de la polimerasa convencional para el gen ARNr16S empleando los partidores P0/P6 o rrs. Posteriormente, alas cepas identificadas se les determinó el comportamiento frente antimicrobianos de uso común en endodoncia y a NPCu tanto en su forma planctónica como en tres modelos ex vivo de biopelícula formado sobre paredes dentinarias tanto con técnicasrecuento de unidades formadoras de colonia y microscopía confocal. Por último, se relacionó la diversidad bacteriana y el comportamiento de las cepas frente a los antimicrobianos con los parámetros clínicos de los pacientes. El análisis de coordenadas principales PCoA indicó una separación entre individuos con historia clínica ASA I y ASA II-III basada en la relación filogenética de la comunidad bacteriana presente en cada muestra. Las estimaciones con el índice Chao1 no fueron diferentes entre los grupos, excepto en lo que respecta a la historia clínica, donde ASA II-III presentó mayor estimación de riqueza, así como mayor índice de diversidad de Shannon. El nivel de PAI 5 aumentó el índice de diversidad de Shannon en comparación con PAI 4 y este índice se redujo en pacientes sintomáticos. En todos los grupos, Proteobacteria fue el phylum más abundante seguido de Bacteroidetes. Sin duda, la familia de mayor abundancia fue Pseudomonadaceae, seguida de pequeñas variaciones en la abundancia de otros grupos taxonómicos dependiendo de la historia del paciente. Se identificaron 16 cepas aisladas en condiciones aeróbicas, 10 de las cuales correspondieron a Pseudomonas spp. y otras 6 cepas correspondientes a los géneros Streptococcus y Staphylococcus. Por otro lado, se identificaron 15 cepas aisladas en condiciones anaeróbicas, 6 de las cuales correspondieron a anaerobios estrictos, principalmente Propionibacterium spp. y otras 10 cepas anaerobias facultativas correspondientes principalmente al género Streptococcus spp. y Staphylococcus spp. Se obtuvo para todas las cepas la media geométrica de las concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) siendo de amoxicilina 27,44 μg/mL, de amoxicilina/ácido clavulánico 10,63 μg/mL, de tetraciclina 2,25 μg/mL, de claritromicina 59,7 μg/mL, de eritromicina 65,6 μg/mLy de metronidazol 114,03 μg/mL. A las 31 cepas bacterianas identificadas se les determinó la CMI y la concentracion mínima bactericida (CMB) de nanoalambres de cobre (NWCu) y NPCu, utilizando como control de nanopartículas de Oxido de Zinc (NPZnO). Los valores de CMI y CMB estuvieron en el intervalo de 100 y >2500 μg/mL y 250 y >2.500 μg/mL, respectivamente. Sobre la base de valores medios, la actividad antibacteriana de las tres nanoestructuras en orden ascendente fue NPCu, NWCu y NPZnO. NPCu mostraron buena actividad antimicrobiana a las concentraciones ensayadas, en comparación con otros informes de literatura. Al probar un primer modelo ex vivo de biopelícula aeróbica no madura multiespecie, tratada con CuNP, con la técnica de recuento en placa, se presentan diferencias significativas entre la aplicación de CuNP como medicación y como irrigante, comportándose de igual manera con la medicación convencional de hidróxido de calcio, a 1 y 7 días. En los ensayos de evaluación de viabilidad celular con microscopía confocal sobre un segundo modelo de biopelícula aeróbica no madura multiespecie, tratada con NWCu a una concentración equivalente a 6xCMI (1500 μg/mL) para E. faecalis , se observó que a mayor tiempo de exposición a las NWCu existió una disminución de la viabilidad. Con un tercer modelo ex vivo de biopelícula, en este caso, anaeróbica madura y multiespecie, se determinó que NPCu, tienen mayor actividad antimicrobiana comparada con otros sistemas de irrigación endodóntica. Se concluye que la microbiota bacteriana asociada a conductos radiculares con diagnóstico de periodontitis apical crónica persistente en el ámbito local es diversa, y evidencia altos niveles de resistencia a los antibacterianos de uso común en el tratamiento endodóntico. Los resultados sugieren que la constitución bacteriana de la periodontitis apical crónica persistente está en relación con al menos dos características clínicas de los pacientes. Finalmente, las nanopartículas de cobre (NPCu) pueden ser una alternativa de tratamiento más efectiva que los antibacterianos intraconducto convencionales empleados actualmente en el tratamiento endodóntico.
Description: Doctor en Ciencias con Mención en Microbiología Universidad de Concepción 2018
URI: http://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/3343
metadata.dc.identifier.other: 240640
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