Estudio de la internalización celular y potencial uso como nanotransportadores de fármacos de dendrímeros paman en neuronas.

Abstract

Los dendrímeros de poliamidoamina (PAMAM) son polímeros hiper-ramificados que han sido ampliamente estudiados como nanotransportadores para la entrega de fármacos (drug delivery). A pesar de los prometedores resultados obtenidos en diferentes modelos in vitro e in vivo, importantes aspectos acerca de su interacción con neuronas y el sistema nervioso central (SNC) para generar aplicaciones seguras y más efectivas dirigidas a enfermedades que afectan dicho sistema, aún no han sido dilucidados. Teniendo esto en consideración, la presente tesis se enfocó en el estudio de tres aspectos relevantes acerca de la interacción de dendrímeros PAMAM con neuronas y el SNC. Un proceso clave de entender es su mecanismo de internalización celular dada su influencia directa en su distribución intracelular, asociación a organelos, cinética de ingreso y liberación del cargo transportado. Cuatro dendrímeros marcados con una sonda fluorescente basados en PAMAM G4 con diferentes propiedades superficiales fueron estudiados: G4 no modificado, con una superficie de carga positiva; PPEG50, con una sustitución del 50% de sus grupos amino superficiales con moléculas neutras de polietilenglicol; PAc, con una sustitución del 30% de sus grupos amino superficiales con moléculas aniónicas de acrilato; y PFO25, modificado con folato en un 25% de los grupos amino terminales. Imágenes de microscopía confocal mostraron que tanto G4 como PFO25, ingresan en neuronas hipocampales, no así PPEG50 ni PAc. La colocalización con marcadores de endocitosis y experimentos de internalización utilizando inhibidores de endocitosis demostraron que la endocitosis mediada por clatrina es el mecanismo principal de ingreso de G4, mientras que la endocitosis mediada por clatrina y caveola están involucradas en la internalización de PFO25. Estos resultados muestran la existencia de diferentes mecanismos de internalización para los dendrímeros PAMAM en neuronas y la posibilidad de controlar sus propiedades de internalización con funcionalizaciones específicas. Por otra parte, es de gran relevancia determinar la biocompatibilidad de los sistemas de entrega de fármacos. Sin embargo, los posibles efectos tóxicos de los dendrímeros PAMAM en neuronas no han sido totalmente investigados, y aspectos importantes como efectos en la transmisión sináptica no han sido explorados. Por lo tanto, se estudió el efecto de PAMAM G4 con su superficie no modificada de carga positiva en neuronas hipocampales y se compararon los resultados con dendrímeros funcionalizados en un 25% de sus grupos superficiales con folato (PFO25) y polietilenglicol (PPEG25). Dendrímeros G4 redujeron la viabilidad celular en forma significativa, lo cual fue atenuado por ambas modificaciones químicas. Registros de patch clamp demostraron que G4 induce un incremento de 7,5 veces en la carga transferida por la membrana como una medida de la permeabilidad de membrana. Más aun, el tratamiento con este dendrímero aumentó el Ca2+ intracelular en 8 veces con una disrupción total del patrón normal de incrementos transitorios, teniendo como consecuencia que el tratamiento con G4 aumentó la liberación de vesículas sinápticas y la frecuencia de eventos sinápticos en 2,4 y 3 veces, respectivamente. Los tratamientos con PFO25 y PPEG25 no alteraron la permeabilidad de membrana, el ingreso total de Ca2+, la liberación de vesículas sinápticas ni la frecuencia en la actividad sináptica. Estos resultados demuestran que los dendrímeros G4 catiónicos tienen efectos neurotóxicos e inducen alteraciones en la actividad sináptica normal, mientras que dichos efectos son prevenidos mediante la modificación del 25% de su superficie ya sea con folato o polietilenglicol. Finalmente, la biodistribución de los dendrímeros PAMAM y la mejora de su capacidad para alcanzar el parénquima del SNC por medio de modificaciones químicas fue evaluada empleando dendrímeros G4 no modificados y G4 funcionalizados en un 40% de sus grupos superficiales con folato (PFO40). Para ello, dendrímeros marcados con una sonda fluorescente fueron inyectados en ratones C57BL/6J y se obtuvieron diferentes cortes de tejido para su análisis en microscopía confocal. Aunque los resultados no mostraron una mejora en el direccionamiento al SNC inducida por la modificación con folato, un alto grado de localización de ambos dendrímeros en los plexos coroideos fue evidenciado, lo cual sustenta la idea de que es posible generar sistemas capaces de unirse a los mecanismos de transporte de esta región para alcanzar las células del parénquima nervioso. En conjunto, los resultados de la presente tesis demuestran la importancia de las propiedades superficiales de los dendrímeros PAMAM en su interacción con neuronas y la posibilidad de optimizar sus características como nanotransportadores dirigidos al SNC a través de funcionalizaciones en su superficie.