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Title: Evaluación del impacto de la exposición prenatal a un exceso de testosterona sobre la estructura y funcionalidad del páncreas endocrino en ovejas.
Authors: Recabarren Morgado, Sergio, Supervisor de Grado
Carrasco Morales, Albert Ronald
Keywords: Ovejas - Chile;Ovejas - Enfermedades;Desarrollo embrionario
Issue Date: 2020
Publisher: Universidad de Concepción, Facultad de Ciencias Veterinarias.
Abstract: EVALUACIÓN DEL IMPACTO DE LA EXPOSICIÓN PRENATAL A UN EXCESO DE TESTOSTERONA SOBRE LA ESTRUCTURA Y FUNCIONALIDAD DEL PÁNCREAS ENDOCRINO EN OVEJAS El feto es un individuo con un potencial genético determinado durante la fecundación. Sin embargo, el fenotipo que adquirirá este individuo depende de la forma en que se exprese su patrimonio genético en función del cómo el ambiente module este proceso. Por ello, las características morfológicas y fisiológicas que tendrá un individuo pueden ser modificadas de acuerdo a las condiciones y las exigencias del ambiente, en función del genoma que este alberga para asegurar la sobrevivencia, proceso conocido como plasticidad. Varias sustancias son capaces de modificar el entorno en el que un individuo vive, incluso durante la vida embrionaria y fetal, provocando una desviación en el desarrollo denominada reprogramación. Entre estas sustancias, la exposición fetal a un exceso de testosterona es un fenómeno que provocaría una reprogramación del desarrollo de este individuo incrementando el riesgo a que padezca diabetes mellitus tipo 2 durante la vida adulta. El objetivo del estudio fue evaluar el efecto de la administración de testosterona, en ovejas gestantes, sobre la fisiología de la madre, las variables morfológicas y endocrinometabólicas de los fetos hembra, la sensibilidad de los tejidos a la insulina en distintas etapas de desarrollo somático (26, 30 y 38 semanas de edad) y el efecto de la administración de testosterona en hembras adultas enteras y ooferectomizadas sobre la sensibilidad a la insulina y la estructura y funcionalidad del páncreas endocrino. Para esto, un rebaño de ovejas adultas de 2-3 años de edad fueron cruzadas con machos de fertilidad probada. El día 28 tras la cruza se confirmó la gestación por ultrasonografía y las hembras preñadas fueron separadas en dos grupos considerando las variables peso y edad como criterios de selección. Un grupo de estas hembras fue sometido a un protocolo de androgenización, que consistió en la administración por vía intramuscular de una solución de propionato de testosterona disuelta en aceite de maravilla, dos veces por semana, en dosis de 30 mg/oveja desde el día 30 al 90 de gestación y 40 mg/oveja desde el día 91 al 120 de gestación (Madres-T). Otro grupo de hembras gestantes (Madres-C) sólo recibió el vehículo en el que se diluyó la testosterona durante el periodo experimental. Desde la cuarta a la decimoséptima semana de gestación las hembras gestantes fueron pesadas y se colectaron muestras de sangre yugular desde las que se determinaron distintas variables endocrino-metabólicas. A los 120 días de gestación en un grupo de hembras preñadas se realizó una cesárea en la que se extrajeron los fetos hembra, éstos fueron pesados y se registraron las medidas zoométricas, se colectó una muestra de sangre yugular para realizar análisis endocrinos y metabólicos. Otro grupo de hembras preñadas parieron y las crías hembra fueron empleadas en los siguientes experimentos. En estas crías, a las 26 semanas de edad (periodo considerado peripuberal), se realizó un test de tolerancia a la glucosa endovenosa (TTGEV) durante la fase folicular del ciclo estral. Tras este estudio la mitad de las hembras de cada grupo fueron ooferectomizadas. A las 30 semanas de edad (periodo considerado como postpuberal temprano) se realizó un segundo TTGEV en las hembras enteras y ooferectomizadas control y expuestas prenatalmente a un exceso de testosterona (EPT) para evaluar el efecto de los esteroides endógenos de origen ovárico sobre la sensibilidad a la insulina. Desde las 30 a las 38 semanas de edad, a las hembras se les inyectó testosterona, en dosis de 40 mg/oveja dos veces por semana y, una vez finalizado este protocolo, se les realizó un tercer TTGEV para evaluar el efecto de la hiperandrogenemia crónica sobre la sensibilidad a la insulina. Adicionalmente, durante esta etapa (38 semanas de edad, periodo considerado postpuberal tardío) un grupo de hembras ooferectomizadas sólo recibió una dosis de testosterona (40 mg/oveja) y se realizó un TTGEV, previo y 48 horas tras la administración de testosterona, para evaluar el efecto agudo de la administración de este andrógeno sobre la sensibilidad a la insulina. Dos días tras este ensayo las hembras fueron eutanasiadas y muestras de tejido pancreático fueron obtenidas para estudios histológicos y moleculares (qPCR y Western-blot) con el objetivo de evaluar la secreción y producción de insulina estimulada por glucosa y la mantención del fenotipo funcional de las células endocrinas pancreáticas. Los resultados se expresaron como promedio  EEM. Se realizó un análisis de normalidad y la comparación entre los grupos se llevó a cabo por medio de pruebas paramétricas o no paramétricas de acuerdo a la distribución determinada (comparación de medias, correlaciones zoométricas y diferencias en la dinámica de la concentración plasmática de las variables endocrinas y metabólicas, entre otras). Los análisis fueron realizados con el programa GraphPad Prism 8 considerando un valor de P<0,05 como una diferencia estadísticamente significativa entre los grupos. La administración de testosterona en las madres gestantes provocó un aumento sostenido en la concentración plasmática de testosterona por el periodo en que se inyectó este andrógeno, sin afectar otras variables endocrinas y metabólicas. A los 120 días de gestación, la concentración plasmática de colesterol total, testosterona total y libre fue significativamente mayor en las madres tratadas y la concentración plasmática de progesterona fue menor en este grupo (Madres-T). En los fetos hembra del grupo tratado (fetos-T) la concentración plasmática de testosterona y estradiol fue mayor y la de insulina, IGF-II y adiponectina fue menor respecto a los fetos control. Además, la distancia anoapertura genital y apertura genital-ombligo fue mayor y menor en los fetos-T, respectivamente, y el peso de la glándula adrenal derecha y el ovario izquierdo fue menor en este grupo de fetos. A las 26 semanas de edad, no hubo diferencias entre los grupos de hembras en las variables endocrinas y metabólicas, ni en los índices de sensibilidad a la insulina estimados a partir de los resultados del TTGEV. En las hembras-T enteras, a las 30 semanas de edad, durante el TTGEV secretaron más insulina que las hembras-C, sin presentar diferencias en esto, en la relación insulina/glucosa o en el ISI-C. Sin embargo, el ISI-Grulet fue menor y la tasa de desaparición de la glucosa (TDG) fue mayor en las hembras-T. A las 38 semanas de edad, tras la administración crónica de testosterona, el promedio de la concentración plasmática de insulina durante el TTGEV fue mayor en las hembras-T, provocando un aumento en el área bajo la curva estimulada (ABC-E), sin cambios en los otros índices de sensibilidad a la insulina. En las hembras ooferectomizadas a las 30 semanas, el promedio de la concentración plasmática de glucosa y la dinámica de esta, durante el TTGEV, fue menor en las hembras-Tovx. No se evidenciaron diferencias en la insulina secretada o en los índices de sensibilidad a la insulina estimados. Tras la administración aguda de testosterona, el promedio de la secreción de insulina fue significativamente mayor en las hembras-C previo y 48 horas tras la administración de testosterona, y el ISI-Composite fue menor en este grupo de hembras tras la administración de testosterona. En cambio, la administración crónica de testosterona, no generó cambios en la dinámica de la concentración plasmática de insulina y glucosa, pero la TDG fue mayor en las hembras-Tovx. Respecto a los análisis morfológicos y moleculares pancreáticos, el peso absoluto y relativo del páncreas fue similar entre los grupos, el número de islotes de Langerhans fue mayor en las hembras-T y el área y perímetro de los islotes no presentó diferencias, pero las hembras EPT presentaron una mayor frecuencia relativa de islotes pequeños. El área inmunorreactiva a insulina en los islotes fue significativamente menor en las hembras-T, y no hubo cambios en la inmunorreactividad para glucagón o somatostatina entre los grupos. Adicionalmente la distribución de los islotes de Langerhans en las hembras-T se alteró, evidenciándose numerosas células β en la periferia de los islotes y, en aquellos de mayor área, se presentaron células sin inmunorreactividad a insulina, glucagón o somatostatina. A nivel molecular, la expresión del ARNm de insulina presentó una tendencia a ser menor en las hembras-T, la expresión de GLUT2 fue mayor y la de KCNJ11 menor en estas hembras. Además, la expresión de NKX6.1 tuvo una tendencia a ser mayor y la de PDX1 menor en este grupo. La expresión de AKT y GLUT4 fue menor en las hembras EPT. La cuantificación del contenido proteico de insulina y PDX1 no presentó diferencias entre los grupos, pero se evidenció que PDX1 se localiza mayormente en el núcleo en las hembras-T. Estos hallazgos indican que la administración de testosterona en ovejas gestantes, altera el medio en el que se desarrolla el feto, debido a que la hiperandrogenemia inducida en la madre es capaz de alcanzar a este, provocando una desviación en el desarrollo del feto que incrementa su predisposición a padecer resistencia a la insulina durante su vida adulta. Así, tras la exposición a un segundo evento durante la vida postnatal, hiperandrogenemia crónica, se activarían los efectos establecidos previamente durante la vida prenatal. A pesar de esto, el páncreas alberga varios mecanismos morfológicos y moleculares que pueden compensar inicialmente estas alteraciones, pero finalmente se agotan provocando una disfuncionalidad de las células β, lo que desencadena una alteración en la homeostasis de la glucosa y diabetes mellitus tipo 2.
Description: Tesis para optar al grado de Doctor en Ciencias Veterinarias.
URI: http://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/544
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