Microscopía de desenfoque : implementación y aplicaciones.

Abstract

El trabajo presentado en esta tesis contempla la implementación experimental y el desarrollo de programas computacionales para llevar a cabo la técnica conocida como Microscopía de Desenfoque con el propósito de utilizarla en el estudio de organismos biológicos. Junto con esto se realiza una aplicación nueva de esta técnica, que consiste en investigar, en tiempo real, como la droga antinflamatoria Naproxeno afecta las membranas de los glóbulos rojos humanos (eritrocitos). El primer estudio realizado mediante Microscopía de Desenfoque fue la visualización y reconstrucción tridimensional de los eritrocitos, lo que permitió diferenciar de forma clara las etapas de deformación que sufrió su membrana debido a la interacción con la droga. Los primeros cambios de forma observados, a medida que la droga entraba al eritrocito, fueron aquellos que llevaron a este desde su forma de discocito hacia una forma de bordes ondulados y a medida que la concentración fue aumentando empezaron a aparecer espículas o protuberancias, hasta cambiar completamente su forma hacia una estructura erizada denominada equinocito, propia de una anomalía llamada equinocitosis. Como resultado importante, se observó que los cambios producidos por el Naproxeno son reversibles y que mediante una disminución de la concentración de droga en la solución, esta puede salir de la membrana recuperando el eritrocito su forma original (discocito). Las reconstrucciones tridimensionales permitieron estimar el área y volumen de los eritrocitos en todas sus etapas, tanto de drogado como de recuperación. El resultado indicó cambios de área y volumen muy pequeños y sin ningún comportamiento monotónico, lo que permite descartar procesos de ingreso o salida de líquido entre el medio interno de los glóbulos rojos y el exterior, fenómenos típicos que ocurren por modificaciones de PH de la solución, y concluir que las deformaciones ocurren exclusivamente por efecto de la droga. El segundo estudio realizado consistió en la medición de fluctuaciones que ocurren en la membrana del eritrocito, debido a interacciones térmicas y procesos metabólicos internos. Las fluctuaciones disminuyeron a medida que la concentración de droga aumentaba, lo cual puede significar una modificación de la elasticidad y de la vitalidad del glóbulo rojo. Las experiencias realizadas y sus resultados, permiten establecer que las técnicas de Microscopía de Desenfoque, como fueron implementadas, constituyen una eficaz herramienta para estudios biológicos, motivando la realización de nuevos experimentos.