Caracterización de la interacción ALP-Mn2+.

Abstract

La agmatina es sintetizada por descarboxilación de la L-arginina, reacción catalizada por la enzima arginina descarboxilasa, la que a su vez es hidrolizada por la agmatinasa generando urea y putrescina. Esta amina catiónica se ha asociado a importantes acciones que incluyen: modulación de la liberación de insulina y de la excreción de sodio renal, inhibición de la síntesis de óxido nítrico, reducción de la dependencia al alcohol y morfina, y acciones neurotransmisoras. Nuestro grupo de investigación ha reportado el clonamiento y expresión de una proteína de cerebro de rata activa como agmatinasa, cuya identidad es tan solo un 12% con respecto a la agmatinasa de E. coli (la mejor caracterizada de las agmatinasas). La proteína denominada ALP (agmatinase like protein), es la única proteína recombinante de mamíferos con una significativa actividad agmatinasa in vitro que ha sido caracterizada cinéticamente. Presenta en su extremo carboxilo un dominio LIM de unión a metales, al cual se le ha asignado un rol regulatorio. Se ha descrito para agmatinasas y para ALP, la dependencia de Mn++ para su actividad catalítica, sin embargo, en ALP no existe evidencia concreta del contenido de Mn++ en la enzima. En éste trabajo pudimos detectar y cuantificar en fracciones purificadas y catalíticamente activas de ALP y especies mutantes, la presencia del metal activador Mn++ que varió de 1 a 2 por subunidad. Al someter a tratamientos con EDTA y posterior diálisis, las muestras perdieron su actividad y su contenido de Mn++. Debido a la baja identidad de secuencia con los miembros de la familia ureo-hidrolasa, en ALP no es posible identificar mediante métodos bioinformáticos los posibles ligandos del metal activador Mn++, por esto se reemplazó mediante mutagénesis sitio-dirigida, residuos de histidina, reconocidos como ligandos para el metal en las ureo-hidrolasas.