Caracterización del efecto neuroprotector de alcaloides quinolizidínicos aislados de Cytisus scoparius en un modelo neuronal de la Enfermedad de Alzheimer.

Abstract

Cytisus scoparius o “retamo” es una planta herbácea, introducida en Chile y que pertenece a la familia Fabaceae. Se ha descrito que esta familia posee compuestos de gran valor farmacológico, específicamente por la presencia de alcaloides quinolizidínicos, estos son metabolitos secundarios que se caracterizan por actuar como agonistas de los receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChR), por lo que podrían ejercer efectos neuroprotectores en el Sistema Nervioso Central (SNC) ante la aparición de enfermedades neurodegenerativas seniles como la Enfermedad de Alzheimer (EA). Este tipo de patologías ha ido aumentando en Chile debido al incremento de la esperanza de vida de la población, llegando a una incidencia del 50% en personas mayores de 85 años. La principal causa en el desarrollo de la EA es el péptido β-amiloide (βA), el cual afecta la neurotransmisión, causando una falla sináptica crónica y la posterior muerte celular. En estudios previos, se han descrito las propiedades neuroprotectoras de la nicotina en la EA, la cual previene la neurotoxicidad inducida por el péptido βA, mediante su acción sobre receptores nicotínicos del subtipo 7 y la subsecuente activación de sobrevida celular PI3K/AKT/Bcl-2. Esta evidencia plantea la posibilidad de buscar nuevos agonistas 7 como posibles nuevas terapias para la EA, que no posean los efectos secundarios y adversos de la nicotina. Por este motivo, en este trabajo de tesis, se evaluó si los alcaloides aislados de Cytisus scoparius tienen un efecto protector frente a la toxicidad inducida por el péptido βA en un modelo neuronal in vitro de la EA. El material vegetal fue recolectado en la Comuna de Coronel, Región del Bio-Bío. La obtención de los alcaloides quinolizidínicos se llevó a cabo mediante extracción líquido-líquido con solventes orgánicos, para luego ser analizados y purificados mediante técnicas cromatográficas convencionales. Mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS), se detectó la presencia de tres alcaloides quinolizidínicos en C. scoparius: Esparteína, 17-oxo-esparteína y lupanina. Para evaluar el efecto neuroprotector de estos alcaloides se realizaron ensayos de viabilidad celular, microfluorimetría de calcio citosólico y western blot, utilizando neuronas hipocampales de rata y las líneas celulares PC-12 y HEK293. Los resultados muestran que el extracto total de C. scoparius y esparteína no producen incrementos significativos en la viabilidad de células PC-12, sin embargo, 17-oxo-esparteína y lupanina aumentan significativamente la viabilidad celular, obteniéndose valores de 136,4 ± 7,4% y 144,3 ± 9%, respectivamente. Además, estos alcaloides previnieron la toxicidad inducida por βA (βA: 52 ± 6%; 17-oxo-esparteína + βA: 109,6 ± 7% y lupanina + βA: 116,6 ± 8%). Este efecto protector fue bloqueado al utilizar el antagonista nicotínico α7 α-bungarotoxina (βA: 74 ± 1,8 %; 17-oxo-esparteína + βA: 78,4 ± 2,1% y lupanina + βA: 80,3 ± 1,6%). Adicionalmente, no se observó un efecto protector en células HEK293, las cuales no expresan receptores nicotínicos (βA: 78,9 ± 6,5 %; 17-oxo-esparteína + βA: 82,2 ± 4,3% y lupanina + βA: 84,5 ± 6,7%). En los ensayos de microfluorimetría de calcio citosólico, con neuronas hipocampales, se observó que 17-oxo-esparteína y lupanina incrementan la frecuencia de las transitorias de calcio intracelular con valores de 140 ± 3,4 % y 164 ± 4,6 %, respectivamente. Además, βA redujo la frecuencia a un 63,2 ± 2% y esta disminución fue prevenida con ambos alcaloides (17-oxo-esparteína + βA: 115 ± 3,6% y lupanina + βA: 120 ± 2,7%). Los ensayos de western blot muestran que 17-oxo-esparteína y lupanina aumentan la fosforilación de Akt en células PC-12 a 1 h (βA: 104,3 ± 6,9%; 17-oxo-esparteína + βA: 131,8 ± 14,7% y lupanina + βA: 162,5 ± 12,4%) y a 3 h (βA: 78,96± 5,3%; 17-oxo-esparteína + βA: 113 ± 7% y lupanina + βA: 130 ± 4,5%)., permitiendo correlacionar la actividad de nAChR con una señalización neuroprotectora intracelular. Nuestros resultados sugieren que 17-oxo-esparteína y lupanina ejercen neuroprotección frente a los efectos tóxicos del péptido βA por medio de la activación de nAChR α7, lo cual puede representar un punto de partida en la caracterización de nuevas moléculas anti-EA a partir de fuentes naturales.