Aislamiento y caracterización del gen arsenito oxidasa de Pseudomonas sp.FN-41.

Abstract

El arsénico es un metaloide altamente tóxico especialmente en estado inorgánico como arsenito [As (III)] y arseniato [As (V)]. Se encuentra ampliamente distribuido en numerosos ambientes, en algunos de ellos puede alcanzar concentraciones peligrosas para los humanos, produciendo diversas afecciones a la salud como problemas vasculares en la piel hasta el desarrollo de cáncer. Numerosos estudios muestran que existen bacterias, que cumplen un rol fundamental en el ciclo biogeoquímico del metaloide, cambiando los estados de oxidación, como por ejemplo, transformándolo desde un estado tóxico de arsenito a un estado menos tóxico de arseniato. Dichos microorganismos, presentan diversos mecanismos de resistencia para contrarrestar la toxicidad del metaloide. Los principales mecanismos de resistencia bacteriana se encuentran asociados a determinantes genéticos, los que otorgan la capacidad de realizar dichas transformaciones del metaloide. La facultad para oxidar el arsénico se debe fundamentalmente a la presencia de una enzima, arsenito-oxidasa, la cual oxida As (III) a As (V). Se ha informado que en bacterias heterotróficas la enzima se ubica a nivel del periplasma bacteriano, y en bacterias quimiolitoautotróficas se encuentra en la membrana citoplasmática asociada a la cadena transportadora de electrones. Ésta enzima, es un heterodímero que consta de una subunidad catalítica mayor, que contiene un centro de molibdeno y un centro HiPIP [3Fe-4S] y una subunidad menor, formada por un centro Rieske [2Fe-2S]. Los genes que codifican para la subunidad menor y mayor de la enzima son los asoBA, aroBA y aoxAB, respectivamente. Estos genes se han detectado en una amplia gama de bacterias y Archae, no obstante, no se habian descrito genes involucrados en la oxidación de arsenito en el género Pseudomonas, pero recientemente dos Pseudomonas se informo la presencia del gen. El objetivo del presente trabajo fue caracterizar el gen de la enzima arsenitooxidasa de Pseudomonas FN-41, bacteria arsenito-oxidante, aislada de sedimentos del río Camarones, XV región Chile. Se estudió la ubicación celular de la enzima arsenito oxidasa, mediante la 2 formación de esferoplastos, ultracentrifugación y ruptura celular por prensa French. Se investigó la presencia del gen arsenito oxidasa de la cepa en estudio mediante PCR utilizando partidores degenerados (69F y 1374R). El producto de PCR obtenido fue clonado y secuenciado. Posteriormente se realizaron análisis comparativos con secuencias descritas para los genes asoA, aroA y aoxB mediante Blast y ClustalW, determinando la similitud de aminoácidos, análisis filogenéticos y análisis evolutivos. Los resultados muestran que la arsenito oxidasa de Pseudomonas FN-41 tiene ubicación periplasmática. Un 74.8 % de actividad enzimática respecto a la actividad total, fue encontrada en la fracción periplasmática (0.158 μmoles de DCIP/mgproteína/min). Mediante ultra-centrifugación, la región soluble correspondiente al contenido periplásmico, presentó una mayor actividad enzimática, alcanzando un 87.1% (0.203 μmoles de DCIP/mg proteína/min), respecto a la actividad total. Mediante PCR, se obtuvo un producto de 1200 pb aproximadamente, los que corresponden a la amplificación de la primera mitad de la subunidad mayor de la arsenito oxidasa. El alineamiento de las secuencia aminoacidica de la cepa en estudio con otras secuencias de arsenito oxidasas, permitió determinar los aminoácidos implicados en el sitio de unión del sustrato de la enzima, los cuales corresponden a los residuos H195 y E203. Se identificaron los residuos S98 y A199, que pertenecen a la subunidad catalítica de la enzima. También se identificó el motivo HNRPAYNSE que es altamente conservado en bacterias arsenito oxidante. Los análisis de similitud aminoacídica de la secuencia en estudio respecto al gen aoxB de Cenibacterium arsenoxidans reveló ser un 45.1%, con el gen asoA de Alcaligenes feacalis un 49.6% y con el gen aroA de Rhizobium sp. NT-26 un 45.1%. Estos resultados permiten concluir que en Pseudomonas. sp. FN-41 se encuentra una arsenito oxidasa que se ubica en el espacio periplásmico. Presenta el gen que codifica para la arsenito oxidasa y probablemente es distinto a los ya descritos.