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Title: Dinámica de la respuesta codificante/no-codificante y su rol en la interacción entre el salmón Atlántico (Salmo salar) y Piscirickettsia salmonis.
Authors: Gallardo Escárate, Cristian, supervisor de grado
Valenzuela Miranda, Diego Andrés
Keywords: Salmonicultura;Aminoácidos -- Metabolismo;Genomas;Virus de la Enfermedad Hemorrágica Epizoótica;Enfermedades de los Peces
Issue Date: 2019
Publisher: Universidad de Concepción, Facultad de Ciencias Naturales y Oceanográficas, Departamento de Oceanografía.
Abstract: La Septicemia Rickettsial Salmonidea (SRS) causada por la bacteria Gram negativa Piscirickettsia salmonis es considerado como uno de los principales patógenos que afecta la salmonicultura chilena y una de las amenazas más importantes para el desarrollo sustentable del sector. A pesar de su relevancia, el desarrollo de herramientas efectivas para su control ha estado obstaculizado por distintas brechas de conocimiento a nivel molecular tanto de la bacteria como de su hospedero, así como de sus interacciones durante el proceso infectivo. En este contexto, la presente tesis doctoral busca la generación de conocimiento relevante sobre los mecanismos moleculares implicados en la interacción patógeno-hospedero. La información generada permite su aplicación en nuevas herramientas y estrategias terapéuticas para el control de la enfermedad. Como primera etapa del presente estudio, se utilizaron herramientas en genómica funcional para identificar distintos mecanismos moleculares involucrados en la interacción patógeno hospedero. Interesantemente, los resultados evidenciaron una modulación significativa de transcritos relacionados a la endocitosis mediada por clatrina y homeostasis de hierro durante el proceso infectivo de P. salmonis. Paralelamente, se evidenció un aumento en la expresión de genes que favorecen la endocitosis, pero una disminución en la expresión de los genes vinculados a la maduración del endosoma y fagocitosis. Estos procesos biológicos podrían explicar cómo P. salmonis se desarrolla en vacuolas citoplasmáticas en su hospedador sin que este sea capaz de lograr la maduración de endosomas para la posterior lisis bacteriana. La regulación de genes que participan en la homeostasis de hierro sugiere que la infección de P. salmonis en salmón Atlántico promueve una acumulación de hierro a nivel intracelular, elemento vital para el desarrollo y patogénesis de la bacteria. Esta acumulación podría favorecer la disponibilidad intracelular de hierro para la bacteria, lo que podría contribuir al desarrollo de la enfermedad. Como segunda etapa del estudio, se exploraron las respuestas moleculares del salmón del Atlántico durante la infección con P. salmonis relacionada con RNAs no-codificantes (ncRNAs), incluyendo long non-coding RNAs y micro RNAs (miRNAs). Mediante análisis de co-localización genómica y co-expresión se identificaron lncRNAs putativamente vinculados con la regulación de genes que participan en la endocitosis y homeostasis del hierro. Por otra parte, 99 miRNAs fueron diferencialmente expresados en distintos tejidos de S. salar durante la infección. Mediante predicción de targets, se estableció que estos miRNAs estarían participando en la regulación de distintos genes de inmunidad y particularmente de hepcidin-1, gen previamente vinculado a la respuesta de salmónidos frente a P. salmonis y a la homeostasis de hierro. Aunque el rol de los ncRNAs en la regulación de procesos biológicos en peces requiere de investigación funcional para dilucidar mecanismos específicos, nuestros resultados sugieren la existencia de un rol activo en la regulación de las repuestas de salmónidos frente a infecciones bacterianas. Como tercera parte del estudio, se caracterizó la respuesta transcriptómica de P. salmonis durante el proceso infectivo en salmón Atlántico mediante Dual RNA-Seq. De esta forma, se determino que la bacteria despliega una amplia batería de genes para favorecer la patogénesis en el salmón. Además de la respuesta canónica asociada con virulencia en patógenos intracelulares, se identificó una respuesta transcriptómica común asociada al metabolismo de aminoácidos entre patógeno y hospedero. Experimentos posteriores demostraron que P. salmonis es capaz de explotar distintos tipos de aminoácidos como fuente de energía para favorecer su crecimiento. Ambos resultados sugieren la existencia de una competencia por los nutrientes entre salmón y bacteria, otorgando así nuevos conocimientos sobre la importancia de la inmunidad nutricional y el rol hierro y los aminoácidos durante esta interacción. Finalmente, y con el propósito de identificar cambios genómicos de P. salmonis sobre los mecanismos de virulencia, se realizó un experimento de cultivo continuo de la bacteria en medio libre de células. Los resultados evidenciaron cambios genómicos y transcriptómicos en bacterias cultivadas durante 200 pasajes en medio de cultivo libre de células. Estos cambios involucraron la relocalización y regulación de distintos genes del sistema de secreción tipo Dot/Icm, flagelinas, elementos genéticos móviles (MGE) y de captura de hierro (Vibrioferrin). Una posterior infección en líneas celulares de salmón reveló que la bacteria traspasada sistemáticamente en medio liquido sufrió una clara atenuación en la capacidad de generación de efectos citopáticos y lisis en las células expuestas. En conclusión, los resultados obtenidos nos permiten plantear que mecanismos como la endocitosis mediada por clatrina y la inmunidad nutricional basada en la competencia de hierro y aminoácidos son factores claves de la interacción del salmón con P. salmonis. Por otra parte, los ncRNAs emergen como componentes importantes en la regulación de estos procesos. Finalmente, es necesario seguir investigando si la atenuación patogénica mediada por cultivo continuo en medio libre de células podrá ser usada como base para la generación de una nueva vacuna viva atenuada para el control de SRS, aportando así en un desarrollo más sustentable de la salmonicultura en Chile.
Description: Tesis para optar al grado de Doctor en Ciencias con mención en Manejo de Recursos Acuáticos Renovables.
URI: http://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/693
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