Mecanismos que contribuyen en los diferentes niveles de resistencia a carbapenémicos en cepas de klebsiella pneumoniae productoras de KPC-2 aisladas en Chile.

Abstract

Durante las últimas décadas, los antibióticos carbapenémicos han sido utilizados para el tratamiento de infecciones producidas por bacilos Gram negativos multiresistentes; sin embargo, el incremento en el uso de estos antibióticos ha conducido al aumento en la resistencia a estos antibióticos limitando aún más las opciones terapéuticas para el tratamiento de este tipo de infecciones. En Chile, en el año 2012, se informó el primer hallazgo de aislados productores de la carbapenemasa KPC (Klebsiella pneumoniaecarbapenemase), y a la fecha se han informado 242 aislados productores de esta enzima. El principal mecanismo responsable de la resistencia a carbapenémicos corresponde a la producción de carbapenemasas, no obstante, también se ha asociado con otros mecanismos adicionales. Las cepas resistentes a carbapenémicos pueden exhibir un amplio rango de mecanismos de resistencia de estos compuestos, debido principalmente al diferente nivel de expresión del gen blaKPC, producción de β- lactamasas del tipo BLEE y/o AmpC asociado a una menor expresión de porinas. El objetivo de esta Tesis fue determinar los mecanismos que contribuyen a los diferentes niveles de resistencia a carbapenémicos en cepas de K. pneumoniae productoras de KPC-2 aisladas en hospitales Chilenos. A partir de un grupo de 16 cepas de K. pneumoniae productoras de KPC-2 aisladas en hospitales chilenos durante los años 2012 y 2013, se determinó el nivel de resistencia a los carbapenémicos. Posteriormente, se realizó la selección de 4 cepas con diferente nivel de resistencia a carbapenémicos, secuencio- tipo y plataforma genética del gen blaKPC-2. Se analizó la contribución de los siguientes mecanismos de resistencia 1) Bombas de expulsión: Se realizó ensayos de inhibición en presencia y ausencia de los inhibidores PAβN y CCCP y, por qRT-PCR se determinó la expresión de los genes acrA y ramA. 2) β-lactamasas: Se realizó la detección fenotípica y molecular de β-lactamasas del tipo serino y metalo. 3) Porinas OmpK35 y OmpK36: Se determinó el perfil de proteínas de membrana externa mediante SDS-PAGE, y además por qRT-PCR se determinó el nivel de expresión de los genes ompK35 y ompK36. Adicionalmente, se realizó la construcción de mutantes de las porinas mediante el método de intercambio alélico y se determinó la CMI de carbapenémicos. 4) Enzima KPC: La contribución de KPC se determinó mediante el ensayo de curación del gen blaKPC, y además, se realizó la cuantificación del gen blaKPC y su expresión por qPCR y qRT-PCR, respectivamente. Las bombas de expulsión inhibidas por los compuestos PAβN y CCCP, no contribuyen en la resistencia a carbapenémicos, ya que la CMI no disminuyó en ninguna de las cepas. Por el contrario, se identificó un incremento en la CMI de carbapenémicos en presencia de PAβN, lo cual podría deberse a la alteración en la expresión de los genes de porinas. Por otra parte, se identificó la co-producción de KPC con las β-lactamasas SHV-1, SHV-12, TEM-1, OXA-436 y CTX-M 2. En relación a las porinas se determinó la presencia de inserciones y deleciones en la secuencia nucleotídica en ambos genes. Se identificó que en todas las cepas, OmpK35 estaría ausente y además se identificó variantes de la porina OmpK36. Por otra parte, se determinó que la deleción de los genes ompK35 y ompK36 en K. pneumoniae TS62, no contribuye en la resistencia a carbapenémicos en cepas no productoras de KPC. No se identificó una relación entre el nivel de expresión de los genes acrA, ramA, ompK35, ompK36 y blaKPC-2 con la CMI de carbapenémicos, y mediante la curación plásmidica del gen blaKPC-2 se identificó la pérdida de resistencia a carbapenémicos en todas las cepas. Las cepas de K. pneumoniae productoras de KPC-2 aisladas desde hospitales chilenos presentaron niveles de resistencia a carbapenémicos diferentes entre ellas, principalmente debido a las variaciones en el nivel de expresión del gen blaKPC-2 y en las variantes de porinas. adicionalmente, las bombas de expulsión no contribuyen en la resistencia a carbapenémicos.