Fenotipo heterorresistente a colistín y su relación con la expresión capsular en cepas de Klebsiella pneumoniae productoras de β-lactamasas de espectro extendido.

Abstract

En los últimos años, se ha observado un aumento en la prevalencia de infecciones provocadas por enterobacterias, como Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Serratia spp., Proteus spp. portadoras de determinantes múltiples de resistencia antibiótica, los cuales son consideradas una amenaza mundial dada la escasa disponibilidad de nuevos antibióticos efectivos. Al respecto, las especies que comprenden el complejo Klebsiella pneumoniae, incluyendo K. pneumoniae sensu stricto y K. variicola subsp. variicola, han emergido como importantes patógenos oportunistas multirresistentes, relacionadas con Infecciones Asociadas con la Atención en Salud (IAAS). A lo anterior, destaca la alta prevalencia de especies portadoras de genes codificantes de β-lactamasas de espectro extendido (BLEE) tipo blaCTX-M, blaSHV, blaTEM-2, y carbapenemasas principalmente blaKPC, para las cuales existen pocas opciones de tratamiento. En este contexto, colistín resulta como una última opción de tratamiento efectiva. Pese a lo anterior, resulta preocupante el hecho de la existencia de cepas portadoras de un fenotipo heterorresistentes (HR) a colistín (CST), lo cual podría llevar a la selección de cepas más resistentes con un posible incremento en la tasa de mortalidad. Actualmente, los mecanismos involucrados con el fenotipo heterorresistente a colistín (CST-HR) no están completamente dilucidados. Sin embargo, la evidencia existente estima que son las mutaciones del gen regulador mgrB o mutaciones en alguno de los genes del sistema de dos-componentes como phoPQ, pmrAB, pmrC o crrAB los cuales están relacionados con la expresión de HR. Por su parte, es de sumo interés interesante indagar que otros mecanismos de resistencia no cromosómicos, tales como la hiperproducción capsular, pueden contribuir a la existencia del fenotipo HR. Así, el objetivo de esta tesis fue caracterizar los mecanismos involucrados en el fenotipo CST-HR en cepas de K. pneumoniae productoras de BLEE. Para esto, se identificó la presencia de cepas HR por medio de un análisis de perfil poblacional (PAP) sobre 60 cepas de K. pneumoniae productoras de BLEE, todas susceptibles a colistín. Las cepas HR fueron aisladas y se realizaron pasos sucesivos durante 5 generaciones. Posteriormente, se determinaron los parámetros de crecimiento bacteriano y se realizó la secuenciación del genoma completo (Illumina® MiSeq) utilizando Spades V.3.9. para su posterior ensamblaje. Con los datos obtenidos, se realizó el estudio de los mecanismos de resistencia a colistín empleando el software Galaxy web Server utilizando una base de datos local empleando K. pneumoniae MGH78578 como genoma de referencia para una cepa susceptible a colistín. El estudio anterior fue complementado con la determinación de mutaciones en reguladores wzi, wzc, rcsABC y lon, los cuales se relacionan con la expresión capsular. Adicionalmente, se determinó el nivel de expresión relativa de los genes phoPQ, pmrABD y mgrB y se comparó la cantidad de polisacárido capsular y el potencial Z (Zetasizer Nano ZS90 - Malvern Instrument® ) entre las cepas susceptibles y resistentes, empleando el método fenol-agua ácido sulfúrico y la movilidad electroforética, respectivamente. Finalmente, en el mismo grupo de 60 cepas de K. pneumoniae portadoras de BLEE, se estudió la existencia del fenotipo hipermucoviscoso e hipervirulento realizando un screening con el test de filancia y la búsqueda de genes de virulencia magA, rmpA/A2, ybtS, entre otros, mediante PCR múltiple. En las 60 cepas de K. pneumoniae se encontró ocho cepas con un fenotipo CST-HR, con MIC50 de colistin igual a 50 µg/mL. Además, estas cepas poseen múltiples genes de resistencia destacando la presencia de blaCTX-M-15 y blaCTX-M-2 ; blaSHV-12 y blaOXA-10. Se determinó que las cepas pertenecen a tres linajes diferentes (ST11; ST25 y ST1161) siendo el K.-locus 2 el más prevalente. Por otra parte, se destaca la primera descripción de CST-HR en cepas de ST1161, ST de descripción endémica en Chile. Sobre los mecanismos de resistencia a colistin, se identificó la presencia de múltiples mutaciones en los genes cromosómicos pmrB, phoPQ y mgrB, algunos de los cuales no han sido descritos previamente. Por su parte, se determinaron cambios en los niveles de expresión de los genes reguladores, destacando la disminución en la expresión relativa en mgrB y pmrBD, las cuales concuerdan con la expresión de resistencia a colistín. Por otro lado, se determinó que las cepas CST-HR poseen una carga superficial menos electronegativa y probablemente, esta no se encuentra relacionada con la cantidad de polisacárido capsular. Por su parte, se determinó la relación causal entre la existencia de mutaciones en crrB y la mayor cantidad de polisacárido observada en las cepas HR. Además, se identificó la presencia de dos cepas, una de K. pneumoniae y otra de K. variicola, portadoras de un fenotipo y genotipo hipermucoviscoso e hipervirulento, siendo esta la primera descripción formal en Chile. Finalmente, como conclusión, fue posible identificar la existencia de cepas de K. pneumoniae productoras de BLEE, portadoras de un fenotipo estable de heterorresistencia a colistín, la cuales evidencian niveles elevados de resistencia al antibiótico. De las cepas identificadas, se logró establecer los mecanismos genéticos responsables de la expresión fenotípica de resistencia a colistín las cuales se relacionan con la existencia de alteraciones en el nivel de expresión de genes claves en la incorporación de resistencia a colistín, probablemente, como una consecuencia de las mutaciones identificadas. Se determinó que las cepas heterorresistentes producen una mayor cantidad de polisacárido capsular en comparación a las cepas susceptibles, y que el serotipo capsular presente en las cepas de Klebsiella pneumoniae estudiadas no guardan relación con la existencia del fenotipo HR.