Modificación genética de la ruta de glicosilación en células epiteliales de glándula mamaria.

Abstract

En la actualidad existen diversos sistemas para la expresión de proteínas recombinantes de uso terapéutico, y su elección dependerá del tipo de proteína que se necesita expresar ya que el sistema debe brindar un correcto procesamiento post-traduccional de las moléculas, como el plegamiento de la estructura terciaria y cuaternaria, la glicosilación y sulfatación. Estas modificaciones garantizarán su funcionalidad biológica, con características similares a las de la proteína nativa. La transformación in situ de las células epiteliales de la glándula mamaria de cabras utilizando vectores virales para la modificación genética de hembras adultas, se presenta como una alternativa factible para la expresión de proteínas recombinantes con estructura terciaria y cuaternaria complejas. Además, en este sistema la proteína recombinante se secreta a la leche, que es un fluido de fácil recolección diaria. Sin embargo, las proteínas expresadas presentan un patrón de N-glicosilación característico y definido, que consiste en la presencia mayoritaria de estructuras bi-antenarias y con presencia de un único enlace de ácido siálico terminal. Si bien este patrón es funcional para la actividad biológica de algunas proteínas terapéuticas, no es suficiente para proteínas como la eritropoyetina humana, que presenta un patrón de glicosilación de tipo complejo, tetra-antenario y tetra-sialilado. Por lo tanto, la eritropoyetina expresada en células epiteliales de glándula mamaria de cabras no presenta actividad biológica debido al patrón de N-glicanos que se añade usando este sistema. El objetivo de esta tesis fue modificar in vivo la ruta de glicosilación de las células epiteliales de glándula mamaria de cabra, utilizando la eritropoyetina humana como proteína modelo. Para esto, se utilizaron vectores adenovirales que contienen la secuencia de esta hormona fusionada con al fragmento de la inmunoglobulina G humana Fc (EPOFc). Además, dichos vectores contienen las secuencias de glicoenzimas claves para la obtención de glicanos ramificados y terminados en ácido siálico. Las glicosiltransferasas utilizadas fueron las N acetilglucosaminiltransferasas IV y V (GNT-IV, GNT-V), además, de sialiltransferasa 1 (ST6N). Se transdujeron las glándulas mamarias de cabras con los vectores EPOFc como control y con la combinación EPOFc+GNT-IV, EPOFc+ST6N, EPOFc+GNT-V+ST6N. Los análisis de los patrones de glicosilación de las distintas variantes mostraron diferencias relevantes en comparación al control. En todas las variantes obtenidas se observan estructuras con un mayor grado de ramificación. Además, las variantes que fueron expresadas en conjunto con ST6N presentaron un aumento de estructuras que contienen ácido siálico en comparación a EPOFc, sin embargo, ninguna de ellas mostró un incremento significativo de la actividad hematopoyética medida como porcentaje de hematocrito. Estos resultados preliminares nos permiten demostrar que es posible modificar la ruta de glicosilación de las células epiteliales en la glándula mamaria de cabra.