Departamento de Bioquímica y Biología Molecular - Tesis Magíster
http://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/7414
2024-03-28T13:50:16ZEpigenética y Obesidad: Dilucidando qué Ocurre en las Neuronas Pomc.
http://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/10719
Epigenética y Obesidad: Dilucidando qué Ocurre en las Neuronas Pomc.
Opazo Mellado, Valentina Paz
Las neuronas hipotalámicas POMC desempeñan un papel importante en el comportamiento alimentario, ya que pueden disminuir la ingesta de alimentos y aumentar el gasto energético en respuesta a las necesidades metabólicas. Sin embargo, múltiples evidencias han demostrado que, tras el desarrollo de obesidad, estas neuronas sufren diversas alteraciones en su normal
funcionamiento que afectan su capacidad de inhibir el apetito. Un mecanismo molecular que podría estar involucrado en el desarrollo y/o mantención de estas alteraciones es la metilación del ADN, puesto que tiene la capacidad de regular la expresión génica y está fuertemente influenciada por factores ambientales como la exposición a dietas calóricas. Además, en particular con el gen Pomc, diferentes investigaciones han mostrado que la obesidad induce
la hipermetilación de su promotor, interrumpiendo la señalización normal de la leptina; no obstante, aún se desconocen los efectos a nivel genómico. En este contexto, nos analizamos los efectos de la obesidad sobre el metiloma de las neuronas POMC y asociarlo con cambios en la expresión génica. Para ello, se expuso a ratones transgénicos POMC:eGFP machos a una dieta alta en grasas durante 11 semanas para inducir obesidad mediante dieta. Desde
neuronas POMC purificadas por FACS se prepararon librerías de secuenciación de bisulfito de representación reducida (RRBS), luego de lo cual, se efectuó un análisis de metilación diferencial por locus CpG. Paralelamente, se utilizaron datos de RNA-seq generados a partir de neuronas
POMC sometidas al mismo tratamiento (11 semanas de alimentación y purificación por FACS) para correlacionar los cambios de metilación con cambios en la expresión génica. Nuestros resultados revelan que la obesidad inducida por el consumo de una dieta alta en grasa provoca una profunda modulación del metiloma en las neuronas POMC caracterizada principalmente por la metilación en promotores proximales de los genes y, más específicamente, dentro de motivos de unión a factores de transcripción. Estos cambios en el estado de metilación, si bien ocurren en varios genes relevantes en el funcionamiento de las neuronas POMC (como Pomc, Cartpt
y Stat3), no necesariamente están asociados con una modulación transcriptómica. De la respuesta transcripcional asociada a un cambio de metilación, destaca el aumento de Gal y Loxl3, genes asociados al consumo de grasa y señalización de STAT3, respectivamente; así como la disminución de genes anti apoptóticos como Gdnf y Ntrk1. De esta manera, es importante
considerar que los resultados obtenidos en esta tesis son los primeros en dilucidar los efectos que la obesidad causa en la metilación de ADN a nivel genómico y más específico aún en neuronas POMC purificadas.; Hypothalamic POMC neurons play an important role in feeding behavior, as they can decrease food intake and increase energy expenditure in response to metabolic needs. However, multiple investigations have shown that, after the development of obesity, these neurons undergo several alterations in their normal functions that affect their ability to inhibit appetite. A molecular mechanism that could be involved in the development and/or maintenance of these alterations is DNA methylation since it has the capacity to regulate gene expression and is influenced by environmental factors such as exposure to caloric diets. Furthermore, obesity has been shown to induce DNA hypermethylation at the Pomc promoter disrupting normal leptin signaling, but the effects at the genomic level are still unknown. In this context, we set out to analyze the effects of obesity on the methylome of POMC neurons and associate it with changes in gene expression. For this purpose, male POMC:eGFP transgenic mice were exposed to a high-fat diet for 11 weeks to induce obesity by diet. From FACS-purified POMC neurons, reduced representation bisulfite sequencing (RRBS) libraries were prepared, after which differential methylation analysis per CpG locus was performed. In parallel, RNA-seq data generated from POMC neurons subjected to the same treatment (11 weeks of FACS feeding and purification) were used to correlate methylation changes with changes in gene expression. Our results reveal that obesity causes profound modulation of the methylome in POMC neurons characterized primarily by methylation in promoter regions of genes and, more specifically, within transcription factor binding motifs. These changes in methylation status, although occurring in several genes relevant to POMC neuron function (such as Pomc, Cartpt and Stat3), are not necessarily associated with transcriptomic modulation. Of this transcriptional response, associated with a change in methylation, the increase in Gal and Loxl3, genes associated with fat consumption and STAT3 signaling, respectively, stands out, as well as the decrease in anti-apoptotic genes such as Gdnf and Ntrk1. In this way, it is important to consider that the results obtained in this thesis are the first to elucidate the effects that obesity causes in DNA methylation at the genomic level and even more specifically in purified POMC neurons.
Tesis para optar al grado de Magíster en Bioquímica y Bioinformática.
2023-01-01T00:00:00ZClonamiento y caracterización funcional de la región promotora de la reductasa de ácido deshidroascórbico Glutarredoxina-1 = Cloning and functional characterization of the promoter region of the dehydroascorbic acid
reductase, Glutaredoxin-1.
http://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/6811
Clonamiento y caracterización funcional de la región promotora de la reductasa de ácido deshidroascórbico Glutarredoxina-1 = Cloning and functional characterization of the promoter region of the dehydroascorbic acid
reductase, Glutaredoxin-1.
Binder Saldaña, Pablo Antonio
La Vitamina C es un potente antioxidante que se presenta en dos formas biológicamente
activas, su forma reducida o ácido ascórbico (AA) y su forma oxidada llamada ácido
deshidroascórbico (DHA). Ambas formas son capaces de ingresar a la célula por medio de
dos familias de transportadores, lo cual dependerá del estado redox de la vitamina C. La
forma reducida de la vitamina C ingresa por medio de la familia de co-transportadores de
sodio-ascorbato (SVCT) y la forma oxidada ingresa por medio de los transportadores
facilitativos de glucosa (GLUT). El ácido deshidroascórbico que ha ingresado a la célula
por medio de los GLUTs o que ha sido originado producto de la oxidación de ácido
ascórbico, es rápida y eficientemente reducido por acción de enzimas de actividad
reductasa de ácido deshidroascórbico, las cuales han sido clasificadas en dependientes de
glutatión y dependientes de NADPH para su función catalítica. La totalidad de estas
enzimas de actividad reductasa de ácido deshidroascórbico son expresadas en modelos de
cáncer prostático. Sin embargo, si bien se conoce bastante acerca del metabolismo de la
vitamina C en células normales, es muy poco se sabe acerca de su rol antioxidante en
células tumorales. Datos previos de nuestro laboratorio demuestran que células tumorales
de próstata son capaces de transportar y acumular más vitamina C que células normales, y
que esta acumulación es altamente dependiente de la concentración de glutatión (GSH)
intracelular. Lo anterior sugiere que enzimas con actividad de reductasas de ácido
deshidroascórbico de localización citoplasmática y dependientes de GSH, como
Glutarredoxina-1 (Grx1), serían elementos claves en la regulación del metabolismo de la
vitamina C. Más aun, se propone que estas enzimas participarían en la acumulación y
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reciclaje de la vitamina C en mecanismos asociados a la respuesta frente a estrés oxidativo,
mediante su regulación a nivel transcripcional.
Con el fin de estudiar a nivel transcripcional la regulación de la expresión de la reductasa
de ácido deshidroascórbico Grx1 en modelos de cáncer de próstata, se ha propuesto el
estudio funcional de la región promotora para el gen de esta enzima en la línea celular DU-
145. Considerando como primera aproximación, la región correspondiente a 2.0 kb
corriente arriba de este gen, conteniendo la totalidad de su región 5’UTR se ha logrado el
clonamiento de esta región promotora y el subclonamiento en el vector comercial pGL3-
basic, obteniendo un constructo funcional, en el cual el promotor de Grx1 es capaz dirigir la
expresión del gen reportero luciferasa. A partir de este vector, fueron generados 22
constructos conteniendo deleciones progresivas y selectivas para el promotor de Grx1,
mediante los cuales se ha determinado un promotor mínimo funcional de 139 pb contenido
en la región ubicada entre las posiciones -79 y +59 pb con respecto al sitio de inicio de
transcripción (TSS) y un promotor conteniendo la secuencia mínima requerida para
actividad basal en la región ubicada entre las posiciones -129 y +59 pb respecto al TSS.
Utilizando como modelo la línea celular de cáncer prostático DU-145 para ensayos
funcionales en conjunto con las herramientas MatInspector y ModuleInspector se determinó
la presencia de sitios de unión a las familias de factores de transcripción involucrados a la
respuesta frente a estrés oxidativo AP-1, NFκB, SP-1 y ETS, los cuales se proponen, de
acuerdo a los ensayos funcionales, como los principales moduladores de la respuesta
transcripcional para este gen en modelos de cáncer de próstata.
Tesis para optar al grado de Magíster en Bioquímica y Bioinformática
2011-01-01T00:00:00ZCaracterización de los genes de la familia Fitoeno Sintasa en Brassica napus L.
http://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/6506
Caracterización de los genes de la familia Fitoeno Sintasa en Brassica napus L.
Cárdenas Inostroza, Pablo David
Los carotenoides son pigmentos orgánicos producidos en plantas y algunas
bacterias y hongos. En humanos y animales son obtenidos desde la dieta y
cumplen importantes roles fisiológicos como precursores de vitaminas y
antioxidantes. En la industria son usados como colorantes y suplementos que
son incorporados en alimentos y cosméticos, por lo que existe un gran interés en
fuentes naturales de estos pigmentos. En plantas, el primer paso clave de la ruta
de biosíntesis de carotenoides es catalizado por la enzima fitoeno sintasa (PSY).
En Arabidopsis thaliana, esta enzima es codificada por un gen de copia única,
sin embargo, la existencia de familias de genes PSY se ha documentado en
varias especies cultivables como arroz, maíz y tomate, entre otras. En estas
especies, la subfuncionalización de los parálogos de PSY proporciona un
mecanismo que permite la acumulación de altos niveles de carotenoides en los
tejidos no fotosintéticos (flores y frutos por ejemplo), sin efectos fisiológicos
negativos para los demás tejidos de la planta. En este estudio, nuestro objetivo
fue determinar si existía una familia de genes PSY en Brassica napus (AACC) y
la especies diploides con los genomas parentales Brassica rapa (AA) y Brassica
oleracea (CC). Basados en información de sintenia entre los genomas
estrechamente relacionados de Arabidopsis thaliana, B. rapa y B. oleracea se
identificaron 6 regiones putativas en B. napus que contendrían genes PSY,
correspondiendo 3 a cada genoma parental. Utilizando una estrategia de PCR
solapante, hemos clonado e identificado 3 parálogos en B. rapa, 3 en B.
oleracea y 6 en B. napus. La existencia de esta familia de genes PSY se
confirmó mediante DNA-SSCP y análisis de Southern-blot. Posteriormente, se
analizó su perfil de expresión mediante RT-PCR detectándose la expresión de al
menos un parálogo, aunque a diferentes niveles, en todos los tejidos estudiados.
Para determinar la existencia de subfuncionalización entre los distintos
parálogos, se realizó un análisis de cDNA-SSCP, el cual reveló que en las tres
especies de Brassica estudiadas, al menos uno de los parálogos de PSY se
expresa preferentemente en pétalos. Los antecedentes generados en este
trabajo sugieren la existencia de una vía de síntesis de carotenoides específica
de los cromoplastos en Brassica. El conocimiento de este estudio ayudará en el
futuro desarrollo de cultivares transgénicos y/o convencionales enriquecidos en
carotenoides y confirma a Brassica como un modelo adecuado para el estudio
de la subfuncionalización de genes parálogos en poliploides.
Tesis para optar al grado de Magister en Bioquímica y Bioinformática
2011-01-01T00:00:00ZEstudio de los componentes estructurales que median el proceso de reconocimiento del ADN dañado.
http://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/6505
Estudio de los componentes estructurales que median el proceso de reconocimiento del ADN dañado.
Cifuentes Huerta, Juan José
El daño en el ADN y su reparación juegan roles críticos en enfermedades como el cáncer y el envejecimiento. Sin embargo, cómo las proteínas de detección de daño reconocen diferentes aductos en el genoma y cómo diferentes proteínas de detección pueden reconocer la misma lesión es una pregunta abierta hasta la fecha. Aquí, mediante un análisis estadístico amplio y comparativo sobre estructuras tridimensionales de complejos proteína-ADN dañado y estructuras de ADN aislado demostramos que las lesiones inducen un cambio local en la estructura del ADN ensanchando el surco menor. Ésta característica común es utilizada por las proteínas de detección de daño, las que en este punto intercalan un residuo de fenilalanina u otro residuo con capacidad de apilarse con las bases nitrogenadas ensanchando aún más el surco menor del ADN. Además, mostramos que los residuos de inserción pertenecen a motivos conservados de estructura secundaria. Estas características están presentes en vías de reparación como Nucleotide Excision Repair, Base Excision Repair y Mismatch Repair y en otras proteínas de reparación que no pertenecen a ninguna vía. Finalmente, estas caracteristicas se encontraron en proteínas como la TATA Binding Protein y la High Mobility Group B, indicando un mecanismo común de lectura indirecta de reconocimiento de ADN, que involucra residuos con capacidad de apilamiento y que se basa en un surco menor ensanchado del ADN blanco.
Tesis para optar al grado de Magister en Bioquímica y Bioinformática
2011-01-01T00:00:00Z