Ciencias Biológicas - Tesis Magíster
http://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/7693
2024-03-29T11:32:24ZCaracterización de la expresión de la familia de FGFs y FGFRs en la placa del techo diencefálica durante estadios embrionarios tempranos.
http://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/11520
Caracterización de la expresión de la familia de FGFs y FGFRs en la placa del techo diencefálica durante estadios embrionarios tempranos.
González Olivero, Maryori Fernanda
Los centros organizadores cerebrales son agrupaciones celulares situadas en las fronteras morfológicas que tienen la capacidad de secretar moléculas señalizadoras como las proteínas morfogénicas óseas (BMPs, bone morphogenic proteins), wingless (Wnts) o factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), las cuales influyen en la determinación de la identidad neuronal o glial en células neuroepiteliales adyacentes. Adicionalmente, los centros organizadores secundarios presentan un patrón diferencial de factores de transcripción, diferentes a las zonas aledañas. A la luz de este concepto, el órgano subcomisural (OSC) emerge como un candidato potencial para cumplir con las características de un centro organizador cerebral. Esto se sustenta en su ubicación estratégica en la interfaz entre el diencéfalo y el mesencéfalo, su diferenciación muy temprana como glándula cerebral, su expresión de diversos factores de transcripción, receptores (incluyendo leptina y FGF) y la secreción de OSC-espondina, una proteína vinculada con la proliferación y diferenciación del neuroepitelio y guía axonal. Basándonos en esta información, planteamos la hipótesis de que el OSC podría operar como un centro organizador cerebral secundario. Para dilucidar la función del OSC se realizaron análisis de RNA-seq en dos estadios, validación por RT-qPCR, identificación de proteínas mediante western blot y localización mediante inmunofluorescencia. Nuestro análisis transcriptómico de OSC en estadios HH23 (4 días de desarrollo) y HH30 (7 días de desarrollo) en embriones de pollo revela que el OSC opera como una glándula altamente secretora, con productos que pueden ser clasificados en tres grupos principales, que no son excluyentes entre sí. En primer lugar, identificamos moléculas implicadas en la guía axonal y la neurogénesis. En segundo lugar, encontramos una variedad de moléculas relacionadas con la secreción y la matriz extracelular. Por último, observamos la presencia de factores de crecimiento y hormonas en el OSC. Dentro de los múltiples productos secretorios encontrados, se analizó en detalle la expresión de diversos receptores de FGF en el techo diencefálico. Nuestra evidencia sugiere que el OSC podría secretar FGF hacia el líquido cefalorraquídeo, lo que podría activar señalización paracrina en el neuroepitelio cercano. Además, la presencia de receptores de FGF en el propio OSC sugiere la posibilidad de una señalización autocrina en esta región. Los resultados obtenidos sugieren fuertemente un rol morfogénico del OSC, y apoyan la hipótesis de que sería un nuevo centro organizador cerebral.; Secondary brain organizer centers are cellular clusters located at morphological boundaries that have the capacity to secrete signaling molecules such as BMP, Wnts or FGF, which influence the determination of neuronal or glial identity in the adjacent neuroepithelial cells. This establishes the SCO as a potential candidate for a brain organizing center during early brain development. This notion is supported by several aspects. Firstly, the SCO is strategically located between the diencephalon and midbrain. In its epithelium, it expresses a diversity of receptors, including leptin and FGF, and it secretes SCO-spondin, a protein mostly associated with axonal guidance. These factors collectively position the SCO as a focal point for signaling. Based on this information, we hypothesized that the SCO might operate as a secondary brain organizing center. To elucidate the function of the SCO an initial two-stage RNA-seq analysis was performed validating specific genes using RT-qPCR. Proteins of interest were identified and localized using western blot and immunofluorescence respectively. Our transcriptomic analysis of the SCO at HH23 and HH30 stages in chick embryos reveals that the SCO functions as a highly secretory gland. Its products can be classified into three groups, which are not mutually exclusive. The first group is mostly formed by molecules related to axonal guidance and neurogenesis. While the second group comprises a diverse range of molecules related to secretion and the extracellular matrix. Lastly, we have observed the presence of growth factors and hormones within the SCO. Specifically, we analyzed the expression of several FGFR in the diencephalic roof plate. Our evidence suggests that the SCO may secrete FGF into the cerebrospinal fluid, which could activate paracrine signaling in not only the nearby neuroepithelium but in the SCO itself suggesting the possibility of autocrine signaling.
Tesis presentada para optar al grado de Magister en Bioquímica y Bioinformática.
2023-01-01T00:00:00ZAnálisis de la región catalítica de agmatinase like protein (ALP).
http://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/11256
Análisis de la región catalítica de agmatinase like protein (ALP).
Reyes Cuevas, María Belén
La agmatina es una amina que es hidrolizada por la enzima agmatinasa a putrescina y urea generando una vía alternativa de la síntesis de poliaminas. Esta amina posee propiedades de neurotransmisor y múltiples acciones farmacológicas. En el Laboratorio de Enzimología de la Universidad de Concepción se realizó el clonamiento de una proteína expresada en cerebro de rata con actividad agmatinasa in vitro, la cual fue denominada “agmatinase like protein” (ALP). Esta enzima contiene en su C-terminal un dominio LIM, el cual cumple un rol de regulación auto inhibitoria. ALP requiere manganeso para su actividad catalítica, al igual que las enzimas de la familia ureahidrolasas, sin embargo, posee un bajo grado de identidad con respecto a otras agmatinasas conocidas, por lo que, se desconoce la región y los residuos críticos en la secuencia que participan en la interacción con el cofactor metálico y en el proceso catalítico. En este trabajo a través de herramientas bioinformáticas, se generó un modelo comparativo estructural de ALP a partir del cual se han propuesto residuos putativos que estarían coordinando con los iones de Mn2+. Utilizando este modelo se generaron dos mutantes simples (E288A y D217A), una mutante doble (E288A/K290A) y una mutante triple (N213A/Q215A/D217A), ninguna de las cuales presentó actividad agmatinasa. Estos resultados apoyan nuestro modelo propuesto para los residuos que serían relevantes en la actividad catalítica de ALP y que se dan a conocer en el presente trabajo.; Agmatine is an amine that is hydrolyzed by the enzyme agmatinase to putrescine and urea, generating an alternative pathway for polyamine synthesis. This amine possesses neurotransmitter properties and multiple pharmacological actions. In the Enzymology Laboratory of the University of Concepción, the cloning of a protein expressed in rat brain with in vitro agmatinase activity was carried out, which was called "agmatinase like protein" (ALP), this enzyme contains in its C-terminal a LIM domain, which fulfills a role of auto-inhibitory regulation. ALP requires manganese for its catalytic activity, like the enzymes of the ureahydrolase family, however, it has a low degree of identity with respect to other known agmatinases, therefore, the region and critical residues in the sequence that they participate in the interaction with the metallic cofactor and in the catalytic process. In this work, through bioinformatics tools, a structural comparative model of ALP was generated, from which putative residues that would be coordinating with Mn2+ ions have been proposed. Two single mutants (E288A and D217A), one double mutant (E288A/K290A) and one triple mutant (N213A/Q215A/D217A) were generated from this model, none of which did present agmatinase activity. These results support our proposed model for the residues that would be relevant in the catalytic activity of ALP and that are disclosed in the present work.
Tesis para optar al grado de Magíster en Bioquímica y Bioinformática.
2023-01-01T00:00:00ZEfecto de NUAK1 en el splicing de G6PD dependiente de hnRNPK en células de cáncer colorrectal.
http://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/11124
Efecto de NUAK1 en el splicing de G6PD dependiente de hnRNPK en células de cáncer colorrectal.
Coliboro Dannich, Viviana Ivelise
El cáncer es una patología con elevada incidencia y mortalidad a nivel mundial, donde destaca el cáncer colorrectal. A nivel molecular, las células tumorales requieren reprogramar su metabolismo para poder sobrevivir a condiciones de estrés o permitir la patológica tasa de crecimiento y proliferación. En consecuencia, las células tumorales presentan elevada tasa biosintética, bioenergética alterada y necesidad de balance redox. En particular, se encuentra alterada la vía de las pentosas fosfato, que se ha descrito como fundamental en la transformación neoplásica. Esta vía es regulada principalmente a través de los niveles de G6PD, la enzima limitante. Esta enzima incrementa su expresión frente a distintos contextos, como el estrés oxidativo o el factor de crecimiento insulina. Adicionalmente se ha descrito como blanco de múltiples oncogenes. Un tipo de regulación para G6PD ocurre a nivel post-transcripcional, donde la ribonucleoproteína hnRNPK regula negativamente sus niveles de ARNm maduro al unirse al exón 12 y promover la retención de intrones. De manera interesante, en nuestro laboratorio encontramos que hnRNPK es un interactor nuclear de la quinasa NUAK1 y presenta potenciales sitios de fosforilación para esta quinasa, en los residuos de serina89 y serina417. NUAK1 es una serina/treonina quinasa de la familia de las AMP quinasas que está sobre expresada en diferentes tipos de cáncer y que se ha relacionado con una menor sobrevida y un peor pronóstico en general. Según los antecedentes, propusimos que NUAK1 favorece la respuesta proliferativa al fosforilar a hnRNPK, inactivándola e interfiriendo con su acción en el splicing de G6PD. Para dilucidar esta relación, estudiamos el rol de NUAK1 en el procesamiento de G6PD mediado por hnRNPK. Realizamos modelamientos moleculares para evaluar si la fosforilación de residuos serina89 y serina417 puede inducir un efecto inhibitorio en la unión de hnRNPK al pre-ARNm de G6PD. Obtuvimos un cambio conformacional que impide a la hnRNPK unirse al exón 12 de G6PD de manera eficiente. Por otro lado, evaluamos el efecto de NUAK1 en el procesamiento de G6PD, en la unión de hnRNPK con el ARNm inmaduro de G6PD y adicionalmente diseñamos un reportero de splicing de doble luciferasa. Encontramos que en la línea HCT116P53-/-, NUAK1 favorece el procesamiento del ARNm inmaduro de G6PD asociado a su regulación sobre hnRNPK. Nuestros hallazgos indican que NUAK1 regula los niveles de G6PD, y lo proponen como un potencial promotor de la vía de las pentosas.; Cancer is a pathology with high incidence and mortality worldwide, where colorectal cancer stands out. At the molecular level, tumor cells must reprogram their metabolism to survive stress conditions or allow pathological growth and proliferation rates. Consequently, tumor cells present a high biosynthetic rate, altered bioenergetics, and a need for redox balance. One altered pathway corresponds to pentose phosphate, which is fundamental in neoplastic transformation. This pathway is mainly regulated through levels of G6PD, the rate-limiting enzyme. This enzyme increases its expression in different contexts, such as oxidative stress or insulin growth factor stimulation. Additionally, it has been described as a target of multiple oncogenes. At the post-transcriptional level, hnRNPK negatively regulates G6PD mature mRNA levels by binding to exon 12 and promoting intron retention. Interestingly, our laboratory found that hnRNPK is a nuclear interactor of NUAK1, and it contains two potential NUAK1 phosphorylation sites, serine89 and serine417 residues. NUAK1 is a serine/threonine kinase of the AMP kinase family highly expressed in cancer, which has been associated with decreased survival and a poorer overall prognosis. We proposed that NUAK1 promotes the proliferative response to growth factor by phosphorylating hnRNPK, inactivating it, and interfering with its action on G6PD splicing. To elucidate this hypothesis, we studied the role of NUAK1 in G6PD processing through hnRNPK. We performed molecular modeling to study whether phosphorylation of potential residues for NUAK1 can inhibit the binding of hnRNPK to the G6PD pre-mRNA. We obtained a conformational change that efficiently prevents the ribonucleoprotein from binding to G6PD exon 12. On the other hand, we evaluated the effect of NUAK1 on G6PD processing, the binding of hnRNPK to immature G6PD mRNA, and additionally designed a double luciferase splicing reporter. In the HCT116P53-/- cell line, we found that NUAK1 favors the processing of immature G6PD mRNA associated with its regulation of hnRNPK. Our findings found that NUAK1 regulates G6PD levels, proposing it as a potential promoter of the pentose phosphate pathway.
Tesis para optar al grado de Magíster en Bioquímica y Bioinformática.
2023-01-01T00:00:00ZBiomarcadores Proteicos. Hacia el desarrollo de metodologías para la estimación del intervalo post mortem (IPM) en osamentas humanas.
http://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/11086
Biomarcadores Proteicos. Hacia el desarrollo de metodologías para la estimación del intervalo post mortem (IPM) en osamentas humanas.
Garcés Parra, Camila Catalina
La estimación del intervalo post mortem (IPM) resulta todo un desafío, más aún cuando se enmarca en contextos forenses que requieren establecer la data de muerte de restos en etapas tardías de descomposición. Actualmente, las investigaciones tafonómicas buscan proporcionar marcadores que permitan desarrollar estimaciones precisas y objetivas, de manera tal que sean admisibles en los procesos judiciales. En dicho esfuerzo, los estudios de degradación proteica han resultado prometedores. La presente investigación exploró las dinámicas del proteoma de osamentas humanas a distintos IPM en términos de diversidad y abundancia, a fin de evaluar si estas son informativas para la estimación de la data de muerte en restos óseos. Para ello se tomaron muestras de tejido cortical de costillas y tibias de 15 individuos masculinos con edades entre 20 a 50 años provenientes de contextos cadavéricos y de resacas de cementerio, cuyos IPM corresponden a <1 año, 15 años y 20 años en muestras de costillas, y con IPM de 15 y 20 años para muestras de tibias. Los resultados proteómicos indican que muestras tempranas (IPM<1 año) exhiben una mayor diversidad y abundancia de proteínas que muestras tardías (IPM=15 y 20 años), identificando 7 proteínas discriminantes entre ambos IPM. Se observó que otras 7 proteínas siguen un decaimiento gradual y progresivo en su abundancia que se correlaciona significativamente con el aumento del IPM. A su vez, se evidenció que las propiedades estructurales de las proteínas como el peso molecular y composición aminoacídica podrían ser cruciales para la preservación post mortem. Se sugiere además que el uso de péptidos semitrípticos refleja mejor la
degradación del proteoma en los análisis de espectrometría que los péptidos trípticos.; The estimation of the post-mortem interval (PMI) is a difficult task, even more so when it is framed in forensic contexts that require establishing the date of death of remains in late stages of decomposition. Currently, taphonomic research seeks to provide markers that allow the development of precise and objective estimates, so that they are admissible in legal proceedings. In this effort, protein degradation studies have shown promise. The present investigation explored the dynamics of the proteome of human skeletal remains at different PMI in terms of diversity and abundance, in order to assess whether these are informative for the estimation of the date of death in skeletal remains. For this purpose, samples of cortical tissue
from ribs and tibia were taken from 15 male individuals aged 20 to 50 years old from cadaveric contexts and from cemetery remains, whose PMIs correspond to <1 year, 15 years and 20 years in rib samples, and with PMIs of 15 and 20 years for tibia samples. Proteomic results indicate that early samples (PMI<1 year) exhibit a higher diversity and abundance of proteins than late samples (PMI=15 and 20 years), identifying 7 discriminating proteins between both PMI. Another 7 proteins were observed to follow a gradual and progressive decay in abundance that correlates significantly with increasing PMI. In turn, it was evidenced that protein structural properties such as molecular weight and amino acid composition could be crucial for post-mortem preservation. It is further suggested that the use of semi-tryptic peptides better reflects proteome degradation in spectrometric analysis than tryptic peptides.
Tesis para optar al grado de Magíster en Biotecnología Molecular.
2023-01-01T00:00:00Z