Departamento de Microbiología - Tesis Doctorado
http://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/7739
2024-03-28T11:47:00ZEfecto individual de antibióticos y en combinación con β-Cloro-l-Alanina en la expresión de factores de virulencia relacionados con la formación de biopelículas de Staphylococcus aureus resistente a meticilina de origen intrahospitalario.
http://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/11713
Efecto individual de antibióticos y en combinación con β-Cloro-l-Alanina en la expresión de factores de virulencia relacionados con la formación de biopelículas de Staphylococcus aureus resistente a meticilina de origen intrahospitalario.
Quezada Aguiluz, Mario Andrés
Staphylococcus aureus es un importante patógeno bacteriano implicado en infecciones humanas y animales. Desde su aparición, al inicio de la era antibiótica, S. aureus resistente a meticilina (SARM) ha mostrado gran capacidad de incorporar genes que codifican determinantes de resistencia a múltiples antibióticos y un gran arsenal de factores de virulencia. Además, SARM representa un gran problema debido la persistencia de infecciones asociadas a dispositivos médicos, principalmente por la capacidad de formar biopelículas, permitiéndole resistir el tratamiento antibiótico, incluso en cepas que no presentan determinantes genéticos de resistencia, lo que finalmente ocasiona el retiro de la prótesis del paciente. En el último tiempo, se han probado alternativas al tratamiento terapéutico habitual, empleando combinaciones de antibióticos usados en la práctica clínica, o bien, utilizando compuestos capaces de desagregar biopelículas. En algunos aislados de SARM se ha demostrado que el uso de algunos antibióticos puede incluso aumentar la expresión de genes implicados en la formación de biopelículas, generando fenotipos hiperadhesivos. Por esta razón, es importante conocer la capacidad de formación de biopelículas y la epidemiología de las cepas de SARM circulantes en Chile. Recientemente, β-cloro-L-alanina (β-CLA), un compuesto con actividad antibacteriana, ha mostrado desagregar biopelículas de SARM en combinación con fosfomicina. Sin embargo, se desconoce el efecto de este compuesto en combinación con otros antibióticos usados en clínica sobre la expresión de los genes que codifican factores de virulencia asociados a la formación de biopelículas. Es por esto, que en esta tesis doctoral se planteó como objetivo general caracterizar las cepas de SARM provenientes de hospitales de Chile y determinar el efecto de antibióticos utilizados en el tratamiento de SARM y la combinación de ellos con β-CLA en la formación de biopelículas como también en la expresión de genes que codifican factores de virulencia asociados con esta capacidad de cepas de SARM aisladas en hospitales de Chile. Inicialmente, se trabajó con 50 cepas categorizadas por el Instituto de salud Pública de Chile como SARM hospitalarias, aisladas entre los años 2007 y 2017, las cuales fueron caracterizadas en función del perfil de susceptibilidad a linezolid, daptomicina y vancomicina; el tipo de cassette SCCmec; y tipificación molecular mediante macrorrestricción con enzima SmaI y electroforesis de campo pulsante (PFGE). Además se confirmó el fenotipo de meticilino resistencia mediante la prueba de susceptibilidad a cefoxitina y la detección del gen mecA por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) convencional. Posteriormente, se realizó la secuenciación del genoma completo (Illumina® MiSeq) utilizando Unicycler v0.4.8 y Spades v3.15.4 para su ensamblaje, visualización con Bandage v0.8.1 y anotación genómica mediante Prokka. Se identificaron los loci tipo multilocus (MLST), spa type, se confirmó la tipificación del tipo de SCCmec, genes de resistencia a los antimicrobianos y genes de virulencia mediante SpeciesFinder 2.0, MLSTFinder 2.0, SCCmecFinder 1.2, spaTyper 1.0, ResFinder 4.1 y VirulenceFinder 2.0, respectivamente. La capacidad de formación de biopelículas se evaluó mediante ensayos de adherencia en placas de 96 pocillos, y la formación y erradicación de biopelículas en presencia de los antibióticos linezolid, daptomicina y vancomicina solos y asociados con β-CLA fue investigada en placas de poliestireno de 6 pocillos de fondo plano, con una lámina de acero inoxidable lisa, las que posteriormente se sometieron a tinción mediante LIVE/DEAD® Baclight™ Bacterial Viability Kit y analizadas por microscopía electrónica confocal (MEC), para evaluar viabilidad de las cepas y grosor de la biopelícula tras la exposición a los compuestos antibacterianos. Se confirmó el fenotipo meticilino resistente en las 50 cepas referidas por el ISP de Chile, además de la presencia del gen mecA. Se determinó que el 76% de las cepas de SARM presentaban el SCCmec tipo I, 14% SCCmec tipo II, 8% el SCCmec tipo IVa y 1 cepa (2%) el SCCmec tipo IVc. El MLST determinó que los tipos de secuencia (ST) prevalentes fueron el ST5 (76%), seguido de los ST105 (14%), ST8 (4%) y los ST5575, ST2802, y ST72 con 2% de prevalencia. El spa type t149 fue prevalente, encontrándose en el 33% de las cepas, seguido del t002 en el 12% de éstas. En cuanto al agr predominante, grupo agr era tipo II (30%) fue el más presente, y en la misma línea, la tipificación del polisacárido capsular determinó que el tipo capsular prevalente era el cap8 (82%), seguido de cap5 (18%). Sin embargo, se descartaron 5 cepas clasificadas originalmente como SARM de origen hospitalaria, pero la tipificación molecular de los SCCmec determinó su origen comunitario. Y de acuerdo al criterio de inclusión no se siguióo trabajando con estas cepas. Las cepas presentaron un perfil de multirresistencia, destacando un 98% de resistencia a los antibióticos del grupo MLSB, sobre 98% a quinolonas y 64% a gentamicina. No se encontraron cepas resistentes a cotrimoxazol, linezolid (LZD), vancomicina (VAN) o daptomicina (DAP). Concordantemente, las cepas presentaron una alta prevalencia de genes de resistencia a distintas familias de antibióticos, como son los que codifican enzimas modificantes de aminoglucósidos: aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia (82%), aad(6) y ant(6)-Ia (64%), aadD (16%), aadE (7%), ant(9)-Ia (98%), ant(4')-Ib (16%), sat4 (40%), aph(3')-IIIa (64%), enzimas metilasas: ermA (98%), ermC (4%), betalactamasa: blaZ (82%), rifampicina fosfotransferasa: rphB (91%), y dihidrofolato reductasa: dfrC (1%). Además, todas las cepas presentaron los genes fosB (resistencia a fosfomicina), norA, mgrA, mepA, mepR, sav1866 (resistencia a fluoroquinolonas), tet38 (resistencia a tetraciclinas) y el sistema regulador de 2 componentes arlRS. Respecto a la caracterización de genes que codifican factores de virulencia implicados en la formación de biopelículas, el 98% de las cepas presentaron el gen fnbA y 26% el gen fnbB (codifiantres de las proteínas de unión a fibronectina A y B, respectivamente); 98% el operón icaABCDR; 80% hly/hla y el todas portaban los genes hlb y hld, codificantes de las hemolisinas b y d, respectivamente. No se detectó la presencia del gen bap, ni de los operones pmsA y pmsB en ninguna de las 45 cepas ensayadas. Sobre el 85% de las cepas presentaron otros genes de virulencia asociados a la adhesión, producción de exoenzimas, toxinas, enterotoxinas y la captación de hierro. Los estudios de relación genética mostraron la presencia de 5 clados, destacando el clado principal con cepas portadoras del SCCmec I distribuídas en la zona centro sur de Chile entre los años 2012 al 2017. Los estudios de formación de biopelículas indicaron que sólo el 73% de las cepas eran productoras de biopelículas, y que el 55% y el 18% del total mostraron un índice de formación de biopelículas débil (DFBP) y moderado (MFBP), respectivamente. De estas cepas se seleccionó una de cada fenotipo y se realizaron ensayos de formación y erradicación de biopelículas en presencia de VAN, DAP, LZD y β-CLA separadamente, y en en combinación con este último. Los análisis de MEC indicaron que la cepa no formadora de biopelículas presentó un aumento de la biomasa viva de la biopelícula madura en concentraciones sub-CMI de VAN, DAP y β-CLA, y una disminución frente a LZD. Las cepas con fenotipo NFBP y MFBP mostraron un aumento en la lectura del espectro rojo cuando se expusieron a concentraciones sub-CMI de LZD, y de las combinaciones LZD + β-CLA, VAN + β-CLA y DAP + β-CLA (p= 0,019) y sub-CMI de VAN, DAP, β-CLA, LZD + β-CLA, VAN + β-CLA y DAP+ β-CLA (p=0,037), respectivamente; lo cual indica que a estas concentraciones ensayadas se induce la muerte celular dentro en la biopelícula, permitiendo además su desagregación.
Las cepa con fenotipo DFBP no mostró cambios en la producción de biopelículas frente a los compuestos ensayados. Los ensayos de expresión de genes de virulencia no arrojaron resultados concluyentes con la metodología ensayada. Las cepas de SARM-AH referidas por el ISP de Chile analizadas en esta tesis, presentan prevalentemente, a nivel tanto fenotípico como genotípico, el perfil clásico del clon chileno/cordobés con un amplio arsenal de genes virulencia, principalmente codificantes de factores de adherencia, exoenzimas, toxinas y hemolisinas. Por otra parte, el uso de sub-CMI β-CLA, VAN y DAP contribuyen al a formación de biopelículas en una cepa con fenotipo no productor de biopelículas. El uso de combinaciones a concentraciones sub-CMI de 1 μg/mL LZD, y de las combinaciones de 1 μg/mL LZD +16 μg/mL β-CLA, 0,5 μg/mL VAN + 16 μg/mL β-CLA y 0,125 μg/mL de DAP + 16 μg/mL β-CLA, provocan una disminución de la formación de esta biopelícula, favoreciendo su erradicación.; Staphylococcus aureus is an important bacterial pathogen implicated in human and animal infections. ince the dawn of the antibiotic era, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) has demonstrated a remarkable ability to acquire genes responsible for resistance to multiple antibiotics, along with a vast array of virulence factors.. In addition, MRSA represents a great problem due to the persistence of infections associated with medical devices, mainly due to the ability to form biofilms, allowing it to resist antibiotic treatment, even in strains that do not present genetic determinants of resistance, which ultimately necessitates the removal of the patient's drug-impregnated medical device. In recent times, alternatives to the usual therapeutic treatment have been tested, using combinations of antibiotics employed in clinical practice and compounds capable of disaggregating biofilms. In some MRSA isolates, it has been shown that the use of some antibiotics can even increase the expression of genes involved in the formation of biofilms, generating hyperadhesive phenotypes. For this reason, it is important to know the biofilm formation capacity and the epidemiology of circulating MRSA strains in Chile. Recently, β-chloro-L-alanine (β-CLA), a compound with antibacterial activity, has been shown to disaggregate MRSA biofilms in combination with fosfomycin. However, the effect of this compound in combination with other clinically used antibiotics on the expression of genes encoding virulence factors associated with biofilm formation is unknown. For this reason, in this doctoral thesis, the general objective was to characterize the MRSA strains from hospitals in Chile and to determine the effect of antibiotics used in the treatment of MRSA and the combination of them with β-CLA on the formation of biofilms and also to determine the impact on gene expression for virulence factors associated with this biofilm-forming ability in MRSA strains isolated from Chilean hospitals. We worked with 50 hospital MRSA strains provided by the Chilean Public Health Institute, isolated between 2007 and 2017, which were characterized based on the susceptibility profile to linezolid, daptomycin, and vancomycin; the SCCmec cassette type; and molecular typing by macrorestriction with SmaI enzyme and pulsed field electrophoresis (PFGE). In addition, the methicillin resistance phenotype was confirmed by means of the cefoxitin susceptibility test and the detection of the mecA gene by conventional polymerase chain reaction (PCR). Subsequently, whole genome sequencing (Illumina® MiSeq) was performed using Unicycler v0.4.8 and Spades v3.15.4 for assembly, visualization with Bandage v0.8.1, and genomic annotation using Prokka. Multilocus type loci (MLST), spa type, SCCmec typing, antimicrobial resistance genes, and virulence genes were confirmed using SpeciesFinder 2.0, MLSTFinder 2.0, SCCmecFinder 1.2, spaTyper 1.0, ResFinder 4.1, and VirulenceFinder 2.0., respectively. Biofilm formation capacity was assessed by adhesion assays in 96-well plates, and biofilm formation and eradication in the presence of the antibiotics linezolid, daptomycin and vancomycin alone and associated with β-CLA was investigated in 6-well polystyrene plates flat bottom wells, with a smooth stainless steel sheet, which were subsequently stained using the LIVE/DEAD® Baclight™ Bacterial Viability Kit and analyzed by confocal electron microscopy (CEM), to assess viability of the strains and thickness of the biofilm after exposure to antibacterial compounds. The methicillin-resistant phenotype, along with the presence of the mecA gene, was confirmed in all 50 strains reported by the Chilean Public Health Institute (ISP), in addition to the presence of the mecA gene. It was determined that 76% of the MRSA strains had SCCmec type I, 14% SCCmec type II, 8% SCCmec type Iva, and 1 strain (2%) SCCmec type Ivc. The MLST determined that the prevalent sequence types (ST) were ST5 (76%), followed by ST105 (14%), ST8 (4%), and ST5575, ST2802, and ST72 with 2% prevalence. The spa type t149 was the most prevalent, identified in 33% of the strains, with t002 found in 12%. Regarding the predominant agr, agr group was type II (30%) was the most present, and in the same line, the typing of the capsular polysaccharide determined that the prevalent capsular type was cap8 (82%), followed by cap5 (18 %). However, molecular typing of SCCmec revealed that 5 strains initially classified as hospital-associated MRSA were actually of community origin. In accordance with the inclusion criteria, these strains were excluded from further study. The strains showed a multiresistance profile, highlighting 98% resistance to antibiotics of the MLSB group, more than 98% to quinolones, and 64% to gentamicin. No strains resistant to cotrimoxazole, linezolid (LZD), vancomycin (VAN) or daptomycin (DAP) were found. Concordantly, the strains presented a high prevalence of resistance genes to different families of antibiotics, such as those encoding aminoglycoside-modifying enzymes: aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia (82%), aad(6) and ant(6)-Ia (64%), aadD (16%), aadE (7%), ant(9)-Ia (98%), ant(4')-Ib (16%), sat4 (40%), aph(3')-IIIa (64%), methylase enzymes: ermA (98%), ermC (4%), beta-lactamase: blaZ (82%), rifampin phosphotransferase: rphB (91%), and dihydrofolate reductase: dfrC (1%). In addition, all the strains presented the genes fosB (resistance to fosfomycin), norA, mgrA, mepA, mepR, sav1866 (resistance to fluoroquinolones), tet38 (resistance to tetracyclines) and the 2-component regulatory system arlRS. Regarding the characterization of genes that encode virulence factors involved in the formation of biofilms, 98% of the strains presented the fnbA gene and 26% the fnbB gene (encoding fibronectin binding proteins A and B, respectively); 98% the icaABCDR operon; 80% hly/hla and all carried the hlb and hld genes, encoding hemolysins b and d, respectively. The presence of bap gene, or pmsA and pmsB operons was not detected in any of the 45 strains tested. Over 85% of the strains presented other virulence genes associated with adhesion, production of exoenzymes, toxins, enterotoxins, and iron uptake. The genetic relationship studies showed the presence of 5 clades, highlighting the main clade with strains carrying SCCmec I distributed in the south-central zone of Chile between 2012 and 2017. The biofilm formation studies indicated that only 73% of the strains were biofilm producers, and that 55% and 18% of the total showed a weak (DFBP) and moderate (MFBP) index of biofilm formation, respectively. One of each phenotype was selected from these strains and biofilm formation and eradication assays were performed in the presence of VAN, DAP, LZD and β-CLA separately, and in combination with the latter. The MEC analyzes indicated that the non-biofilm-forming strain showed an increase in live biomass of the mature biofilm at sub-MIC concentrations of VAN, DAP and β-CLA, and a decrease compared to LZD. Strains with NFBP and MFBP phenotypes showed an increase in the red spectrum reading when exposed to sub-CMI concentrations of LZD, and of the combinations LZD + β-CLA, VAN + β-CLA and DAP + β-CLA (p = 0.019) and sub-MIC of VAN, DAP, β-CLA, LZD + β-CLA, VAN + β-CLA and DAP+ β-CLA (p=0.037), respectively; which indicates that at these tested concentrations cell death is induced within the biofilm, also allowing its disaggregation.Strains with DFBP phenotype did not show changes in biofilm production against the tested compounds. Virulence gene expression assays did not yield conclusive results with the tested methodology. The MRSA-HA strains referred to by the ISP of Chile analyzed in this thesis present predominantly, at both the phenotypic and genotypic level, the classic profile of the Chilean/Cordobes clone with a wide arsenal of virulence genes, mainly encoding adhesion factors, exoenzymes, toxins and hemolysins.
On the other hand, the use of sub-CMI β-CLA, VAN and DAP contribute to the formation of biofilms in a strain with a non-biofilm-producing phenotype. The use of combinations at sub-MIC concentrations of 1 μg/mL LZD, and of combinations of 1 μg/mL LZD +16 μg/mL β-CLA, 0.5 μg/mL NPV + 16 μg/mL β-CLA and 0.125 μg/mL of DAP + 16 μg/mL β-CLA, cause a decrease in the formation of this biofilm, favoring its eradication.
Tesis presentada para optar al grado de Doctor en Ciencias Mención Microbiología.
2023-01-01T00:00:00ZMicrobiota en salmón del atlántico: Evaluación del rol de la comunidad microbiana en peces de cultivo y su relación con la salud durante el ciclo productivo.
http://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/10731
Microbiota en salmón del atlántico: Evaluación del rol de la comunidad microbiana en peces de cultivo y su relación con la salud durante el ciclo productivo.
Morales Rivera, María Fernanda
Existe una creciente preocupación en garantizar el bienestar animal en la acuicultura. A tal efecto, la microbiota intestinal es un campo prometedor para evaluar y mejorar este bienestar. Lo anterior debido a que posee una gran relevancia en el hospedero influenciando, por ejemplo, el sistema digestivo e inmune. En ese sentido, además de la taxonomía, ha crecido el interés por conocer la funcionalidad metabólica de las comunidades microbianas, debido a que ofrece
ventajas al momento de evaluar el efecto sobre los cambios en el entorno. El objetivo de esta tesis fue establecer si la estructura taxonómica y funcional de la comunidad microbiana en salmón del Atlántico brinda herramientas para evaluar el bienestar animal durante el proceso productivo. Para este trabajo, se utilizó la secuenciación de la región V1-V9 del gen del ARNr 16S mediante Nanopore MinION. Posterior a ello, la asignaciones taxonómicas se realizaron mediante la plataforma “Epi2Me de Oxford Nanopore” o por la herramienta “NanoCLUST”. Además, para el cálculo de diversidad taxonómica se utilizó el paquete “Vegan” en el programa “R studio”, con el cual se calculó la diversidad alfa y la estimación de uniformidad por el índice de Pielou. La estructura de la comunidad microbiana se analizó utilizando Bray-Curtis con un análisis de coordenadas principales (PCoA). Por último, la predicción funcional del metagenoma se realizó mediante PICRUSt2 utilizando la bases de datos MetaCyc. Para el primer análisis, se determinó la
taxonomía de muestras de intestino de salmón del Atlántico con distención abdominal (DA), sin distención abdominal (no_DA) y muestras de agua de la Bocatoma (Boca), decantador (Deca), entradas y salidas del biofiltro (BF) de un sistema de recirculación acuícola (RAS) de agua dulce. Esto para identificar la microbiota en peces afectados y enfermos durante un brote epidémico posterior a un evento de vacunación. Las muestras de intestino de los peces con (DA) fueron
las que menores índices de diversidad presentaron, junto con una dominancia de Proteobacteria. Además, Aliivibrio wodanis es el principal patógeno presente en los peces con DA y un probable agente etiológico de los peces enfermos. Por otro lado, la microbiota de los peces no_DA poseen una mayor contribución en los pathway relacionados con metabolismo de aminoácidos y fermentación de ácidos grasos de cadena corta, lo que es indicativo de una mejor salud con respecto a los peces con DA. Adicionalmente, se determinó la contribución al metabolismo de compuestos inorgánicos utilizando la base de datos de “KEGG Ortology” para la construcción de
mapas metabólicos con la herramienta “KEGG Mapper” enfocados en el metabolismo del nitrógeno y sulfuro. Como resultado, encontramos que el metabolismo del sulfuro es el más representado en peces DA. Además, los procesos de desnitrificación y nitrificación se encuentran favorecidos en la muestra de agua Deca, por sobre las otras, lo que tiene estrecha relación con el rol que posee. Posterior a esto, se evaluó la taxonomía de smolts durante su transferencia
al agua de mar bajo diferentes tratamientos y se analizó la metagenómica funcional de la microbiota del intestino de los peces. Esto incluyó un grupo de muestreo sometido a la alimentación mediante una dieta funcional (FD) previo al proceso de transferencia al agua de mar. Todo lo anterior, con el objetivo de evaluar si un cambio gradual en la salinidad (GSC) previo a la transferencia de agua de mar favorece la diversidad de la microbiota por sobre un shock osmótico (SS). Como resultado, encontramos que la riqueza y diversidad microbiana fueron mayores en los peces sometidos a GSC, lo que sugiere una asociación positiva entre la comunidad microbiana y la salud de los peces. Además, se hacen presentes bacterias del género Vibrio en las muestras de intestino de los peces en agua de mar que no estaban presentes en agua dulce ni durante el GSC. Además, los peces alimentados con FD previo a un choque salino, presentan menos abundancia de este género. En cuanto a la funcionalidad metabólica, la biosíntesis de aminoácidos como valina, leucina e isoleucina se encuentran favorecidos en los peces previamente alimentados con FD. Por otro lado, la degradación de aminoácidos esenciales está favorecida en los peces alimentados con FD y en los sometidos a un SS. Por otro lado, la degradación de drogas, contaminantes y otros compuestos aromáticos se encuentran favorecidos en los peces alimentados con FD y en los peces sometidos GSC. Para finalizar, se estudió la microbiota de Caligus rogercresseyi de diferentes zonas del sur de Chile, como potencial reservorio de patógenos que pueden afectar al salmón del Atlántico. Para ello, de los resultados
taxonómicos, se filtraron aquellos que corresponden a bacterias patógenas de peces y se determinaron los índices de diversidad. Se identificaron patógenos pertenecientes al género Tenacibaculum. Adicionalmente, la abundancia y diversidad de patógenos está directamente relacionada con la biomasa de salmón producida en cada una de las zonas. En resumen, el conocimiento de la estructura taxonómica y funcional de la microbiota del intestino nos permite evaluar que peces poseen un mejor estado de salud con respecto a otros. Brindándonos una
herramienta para reconocer signos de enfermedad. Además, nos permite evaluar la calidad microbiológica del agua y nos brinda información sobre la microbiota de patógenos potenciales totales, tanto en el agua como en otros parásitos como C. rogercresseyi.; There is a growing concern to ensure this animal welfare in aquaculture. To this effect, intestinal microbiota is a promising field to evaluate and improve welfare. This is because it has great relevance in the host influencing, for example, the digestive and immune systems. In this sense, in addition to taxonomy, there has been a growing interest in knowing the metabolic functionality of microbial communities, because it offers advantages when evaluating the effect of changes in the environment. The objective of this thesis was to establish whether the taxonomic and functional structure of the microbial community in Atlantic salmon provides us with tools to evaluate animal welfare during the production process. For this work, the sequencing of the V1-V9 16S rRNA region using Nanopore MinION was used. Subsequently, taxonomic assignments were made using the "Epi2Me de Oxford Nanopore" platform or the "NanoCLUST" tool. In addition, the "Vegan" package in the "R studio" program was used to calculate the alpha diversity and the estimation of uniformity by the Pielou index. The microbial community structure was analyzed using Bray-Curtis with a principal coordinates analysis (PCoA). Finally, functional prediction of the metagenome was performed by PICRUSt2 using the MetaCyc database. For the first analysis, the taxonomy of gut samples from Atlantic salmon with abdominal distension (AD), without abdominal distension (no_AD) and water samples from the intake (Mouth), decanter (Deca), inlets and outlets of the biofilter (BF) of a freshwater aquaculture recirculation system (RAS) was determined. This was to identify the microbiota in affected and diseased fish during an epidemic outbreak following a vaccination event. Gut samples from fish with (DA) yielded the lowest diversity indices, along with a dominance of Proteobacteria. In addition, Aliivibrio wodanis is the main pathogen present in DA fish and a probable etiological agent of diseased fish. On the other hand, the microbiota of non-AD fish have a higher contribution in pathways related to amino acid metabolism and short-chain fatty acid fermentation, which is indicative of better health compared to AD fish. Additionally, the contribution to the metabolism of inorganic compounds was determined using the "KEGG Orthology" database for the construction of metabolic maps with the "KEGG Mapper" tool focused on nitrogen and sulfur metabolism. As a result, we found that sulfide metabolism is the most represented in DA weights. In addition, denitrification and nitrification processes are found to be favored in the DECA water sample over the others. This is closely related to the role it plays. Subsequently, the taxonomy of smolts during their transfer to seawater under different treatments was evaluated and, the functional metagenomics of the gut microbiota of the fish was analyzed. This included a sampling group subjected to feeding with a functional diet (FD) prior to the transfer process to seawater. The objective was to evaluate whether a gradual change in salinity (GSC) prior to seawater transfer favors microbiota diversity over an osmotic shock (SS). As a result, we found that microbial richness and diversity were higher in fish subjected to GSC, suggesting a positive association between microbial community and fish health. In addition, bacteria of the genus Vibrio are present in the gut samples of fish in seawater that were not present in freshwater or during GSC. In addition, fish feeding with a FD prior to salt shock show less abundance of this genus. In terms of metabolic functionality, the biosynthesis of amino acids such as valine, leucine and isoleucine are found to be favored in fish previously feeding with a FD. On the other hand, the degradation of essential amino acids is favored feeding with a FD and SS fish. On the other hand, the degradation of drugs, contaminants and other aromatic compounds is favored in FD-fed fish and in fish subjected to GSC. Finally, the microbiota of Caligus rogercresseyi from different areas of southern Chile was studied as a potential reservoir of pathogens that can affect Atlantic salmon. For this purpose, from the taxonomic results, those that correspond to fish pathogenic bacteria were filtered and the diversity indexes were determined. As a result, pathogens belonging to the genus Tenacibaculum were identified. Additionally, the abundance and diversity of pathogens is directly related to the biomass of salmon produced in each of the zones. In summary, knowledge of the taxonomic and functional structure of the gut microbiota allows us to evaluate which fish are healthier than others. This provides us with a tool to recognize signs of disease. It also allows us to evaluate the microbiological quality of the water and provides us with information on the microbiota of potential total pathogens, both in the water and in other parasites such as Caligus rogercresseyi.
Tesis para optar al Grado de Doctor en Ciencias con Mención en Microbiología.
2022-01-01T00:00:00ZProducción de nanopartículas de selenio en Pantoea agglomerans y Lactiplantibacillus plantarum y su aplicación biotecnológica como suplemento dietético para peces salmónidos.
http://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/10418
Producción de nanopartículas de selenio en Pantoea agglomerans y Lactiplantibacillus plantarum y su aplicación biotecnológica como suplemento dietético para peces salmónidos.
Yáñez Lemus, Francisco Orlando
El selenio (Se) es un micronutriente traza esencial para la salud de humanos, animales
y microorganismos. Las nanopartículas de selenio (Se0Nps) atraen el interés de la ciencia y
de diferentes áreas industriales debido a su biocompatibilidad, biodisponibilidad y baja
toxicidad. Por lo tanto, debido a su mayor bioactividad, las Se0Nps se están utilizando en
diversas aplicaciones biomédicas y productivas. En general, Se0Nps pueden ser sintetizadas
mediante métodos físicos, químicos y biológicos. Sin embargo, las Se0Nps sintetizadas
biológicamente demuestran una mayor compatibilidad con órganos y tejidos, humanos y
animales.
El objetivo del presente estudio fue biosintetizar Se0Nps en Pantoea agglomerans UC032 y Lactiplantibacillus plantarum S14 y evaluar su potencial biotecnológico como suplemento
nutricional para el mejoramiento del estado oxidativo, desempeño inmunológico y parámetros
productivos en truchas arcoíris (Oncorhynchus mykiss) de cultivo.
Evaluamos el efecto de las Se0Nps funcionalizadas con L-cisteína (Se0Nps/L-Cys),
como suplemento nutricional, sobre el estado inmunológico, oxidativo y parámetros
productivos en O. mykiss. TEM y SEM-EDS mostraron la acumulación de Se0Nps esféricas
compuestas por selenio elemental (Se0) como depósitos intracelulares y extracelulares en
Pantoea agglomerans UC-32. La capacidad antioxidante in vitro de Se0Nps/L-Cys fue
significativamente más eficiente en la captura de ROS que Se0Nps y Na2SeO3. También
evaluamos el efecto de Se0Nps/L-Cys sobre la viabilidad celular y el estrés oxidativo en las
líneas celulares RTgill-W1 y RTS-11 y cultivo celular T-PHKM de O. mykiss. Se0Nps/L-Cys
mostró ser menos tóxica y con mayor actividad antioxidante comparada con Se0Nps y
Na2SeO3. Finalmente, la dieta Se0Nps /L-Cys tuvo un efecto significativamente mayor en la
actividad de la lisozima plasmática y la actividad del estallido respiratorio (respuesta
inmunitaria innata), en la actividad de la Gpx tisular (estado oxidativo) y en la acumulación de
reservas energéticas y bienestar (parámetro productivo) en los peces cuando se comparó
con el efecto de las Se0Nps y del Na2SeO3.
También obtuvimos bacterias ácido-lácticas (LAB) a partir del contenido intestinal de
trucha arcoíris. De estas, se seleccionaron candidatos probióticos con capacidad de
biosintetizar Se0Nps. Para determinar la potencialidad probiótica, cada cepa LAB fue
evaluada mediante caracterización morfológica y las siguientes pruebas: actividad
antimicrobiana, susceptibilidad antibiótica, actividad hemolítica, catalasa, hidrofobicidad,
viabilidad a pH bajo y tolerancia a sales biliares. Dos cepas de LAB (S4 y S14) cumplieron
con características de probióticos potenciales, pero la cepa S14 redujo Na2SeO3 y biosintetizó
Se0Nps. La cepa S14 se identificó, mediante análisis de ADNr 16S, como Lactiplantibacillus
plantarum. Mediante microscopía electrónica se observó Se0Nps de 98 a 245 nm de diámetro
ubicadas en la superficie celular de S14. La dieta de la trucha arcoíris fue suplementada con
108 UFC g-1 de materia seca de alimento de Lp plantarum S14 enriquecida con Se0Nps
(LABS14-Se0Nps) o sólo con 108 UFC g-1 de materia seca de alimento de Lp. plantarum S14
(LABS14) durante 30 días. Los días 0, 15 y 30 se tomó medidas morfométricas y muestras
sanguíneas y el día 30 además, se obtuvo tejido hepático y muscular de ambos grupos, más
controles (sin suplementación dietética). La suplementación dietaria con LABS14-Se0Nps
mejoró significativamente las actividades de la lisozima plasmática, el estallido respiratorio,
la Gpx tisular y parámetros productivos en comparación con los peces suplementados con
LABS14 y los controles.
Consideramos que las Se0Nps/L-Cys y las LABS14-Se0Nps son un aporte
biotecnológico fácil de implementar, con un reducido impacto ambiental y con potencialidad
de ser usadas por la industria salmonicultora como un suplemento nutricional capaz de
mejorar parámetros fisiológicos y productivos en la trucha arcoíris.
En consecuencia, las hipótesis planteadas en esta tesis fueron aceptadas.
Tesis Para optar al Grado de Doctor en Ciencias, Mención Microbiología.
2022-01-01T00:00:00ZAnálisis de la microbiota y parasitofauna de ejemplares de Dissostichus eleginoides smitt, 1898, capturados en la zona centro-sur de Chile.
http://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/9170
Análisis de la microbiota y parasitofauna de ejemplares de Dissostichus eleginoides smitt, 1898, capturados en la zona centro-sur de Chile.
Fernández Fonseca, Italo Antonio
La carne de pescado presenta propiedades nutricionales que son relevantes en el ámbito de
la alimentación humana, que los convierten en alimentos fundamentales dentro de lo
considerado como alimentación equilibrada y cardiosaludable.
Por su geografía, Chile es uno de los principales países que basan parte de su economía en
la industria pesquera industrial y artesanal. Sin embargo, al igual que el resto del mundo, el
país se enfrenta a la sobreexplotación de sus recursos pesqueros, ya sea por su exceso de
capturas, así como la carencia de información respecto del estatus sanitario de éstas. De
hecho, a mediados de la década pasada se reconoce que las principales pesquerías que
operan en Chile se encuentran sobre explotadas o agotadas.
Es en este contexto que surge, como una pesquería relativamente emergente y valiosa, la
explotación sobre el bacalao de profundidad Dissostichus eleginoides, pez de profundidad
conocido internacionalmente como Patagonian Toothfish o Chilean Seabass. Esta especie,
a pesar de encontrarse presente a lo largo de casi todo el dominio marítimo de Chile, es un
recurso poco conocido desde el punto de vista biológico.
Diversas investigaciones, efectuadas desde hace dos décadas, han dado cuenta de
información respecto de la ecología, alimentación, reproducción, estructura poblacional, etc.
de D. eleginoides. Sin embargo, existen escasos antecedentes respecto de la parasitología
y, sobre todo, de la microbiología de esta especie.
Desde el punto de vista parasitario, se han efectuado investigaciones principalmente en
poblaciones de D. eleginoides localizadas en el Océano Atlántico y en algunas islas
subantárticas. Solo dos trabajos se han realizado en ejemplares capturados en Chile, pero
datan de, a lo menos, una década. En ellos puede apreciarse que la parasitofauna de esta
especie es particularmente distinta de lo reportado en estudios similares en otras
localizaciones.
Por el contrario, desde el punto de vista microbiológico no existen antecedentes en esta
especie, al menos en ejemplares salvajes. Solo se cuenta, a la fecha, con antecedentes
provistos por una investigación efectuada en un ejemplar de D. eleginoides capturado en
aguas australes de Chile, pero que fue mantenido en condiciones de cautiverio de seis
meses.
Investigaciones respecto de la parasitofauna y de la comunidad bacteriana de D. eleginoides
son relevantes dado que para comprender su funcionamiento es necesaria su identificación
y/o cuantificación, lo que a su vez permite inferir respecto de la diversidad poblacional de la
muestra analizada, así como del estado de salud del hospedero en particular.
Por lo mencionado anteriormente, el objetivo del presente trabajo fue caracterizar la
comunidad bacteriana y parasitaria del tracto gastrointestinal de ejemplares de D.
eleginoides, capturados en aguas de la zona centro sur de Chile.
Los resultados obtenidos demuestran, en primer lugar, que la parasitofauna de D. eleginoides
que habitan aguas de Chile parece ser singular, tributando a su rol de carnívoro de tope, pero
correspondiendo a una población particular de la especie. Así mismo, dan cuenta del primer
reporte del parasitismo por Rocinela aff. australis en D. eleginoides y del hallazgo de larvas
de Pseudoterranova sp., cuya presencia solo había sido informada en ejemplares capturados
en otras latitudes. Por el contrario, los resultados a nivel microbiológico no coinciden con lo
previamente reportado debido a, probablemente, limitaciones metodológicas.
Finalmente, tanto en los resultados del ámbito parasitario como microbiológico, las extensas
migraciones y las condiciones batimétricas en las cuales habita D. eleginoides en la costa de
Chile, parecieran seleccionar una comunidad bacteriana y parasitofauna particular, lo que
sería característico y correspondiente con la población o stock pesquero de esta especie en
aguas chilenas. Por lo tanto, y debido a la escasez de antecedentes con que se cuenta a la
fecha, los resultados obtenidos en esta investigación son pioneros en la especie y pueden
servir como línea de base para estudios posteriores.
Tesis para optar al Grado de Doctor en Ciencias, mención Microbiología.
2021-01-01T00:00:00Z