Ciencias Biológicas - Tesis Doctorado
http://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/94
2024-03-29T03:23:02ZEl aumento de la actividad transamidante de TG2 potencia la vía amiloidogénica en modelos de la enfermedad de Alzheimer.
http://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/11567
El aumento de la actividad transamidante de TG2 potencia la vía amiloidogénica en modelos de la enfermedad de Alzheimer.
Panes Fernández, Jessica Daniela
La Enfermedad de Alzheimer (EA) es la principal forma de demencia que afecta a los adultos mayores. Se caracteriza por una muerte neuronal progresiva en zonas de hipocampo, corteza y amígdala. Se postula que uno de los principales agentes tóxicos responsables de la neurodegeneración es la agregación tóxica del oligómeros del péptido β-amiloide (AβOs), ya que inducirían los principales eventos celulares con los que cursa esta patología, tales como dishomeostasis del Ca+2, disfunción mitocondrial, y la falla sináptica. TG2 es una enzima ubicua cuya función principal es la formación de enlaces isopeptídicos entre proteínas o péptidos, cuyo sitio catalítico se activa frente a concentraciones micromolares de Ca2+. Se ha descrito un aumento de la transcripción de TG2 en diferentes modelos transgénicos de la EA, así como en corteza de pacientes con EA. En esta tesis doctoral se evaluaron cambios en los niveles de TG2 en distintos modelos de la EA, y el efecto de la función transamidante de la enzima TG2 en la agregación del péptido Aβ, y sus principales efectos tóxicos en la función mitocondrial y neuronal. Observamos que los niveles de TG2 en el hipocampo de ratones J20 de 10 meses estaban aumentados (246 ± 17%), y que la actividad transamidante estaba potenciada (159 ± 20%), en comparación con animales WT de la misma edad. Observamos un aumento significativo de la expresión de TG2 en lisado total de hipocampo (286 ± 5 %,), y en fracción mitocondrial (313 ± 4 %) de ratones APP/PS1, en comparación con los ratones WT de la misma edad. Además, neuronas del hipocampo tratadas de forma crónica con oligómeros de Aβ (AβOs, 0.5 μM) mostraron un aumento de la inmunoreactividad de TG2 (146 ± 17%) en comparación con células no tratadas. Conjuntamente, evaluamos la capacidad de TG2 para promover los procesos de agregación del péptido Aβ, comparándola con la formación “autocatalítica” previamente estandarizada por nuestro grupo de investigación. La conversión amiloide inducida por TG2, mostró seguir una cinética hiperbólica exponencial, y fue capaz de inducir agregados con un tamaño medio de 7-13 unidades (∼28, 40, 52 kDa) que presentaban una alta citotoxicidad (85 ± 3 %). En tanto que, la formación autocatalítica mostró seguir una cinética sigmoidal, formando agregados más pequeños de tamaño de medio de 7 unidades (∼28 kDa) que presentaban una menor citotoxicidad (69 ± 3 %). El tratamiento agudo con AβTG2 indujo una rápida sobrecarga de Ca2+ citosólico (300 ± 22%) y Ca2+ mitocondrial (335 ± 43%). Utilizando la técnica de PLA, observamos que la formación del complejo IP3R/VDAC1 aumentó en las neuronas expuestas a AβTG2 bajo tratamientos crónicos (220 ± 12%). Mediante registros de patch clamp, observamos un aumento en la actividad neuronal (30 min, 257 ± 14%), que disminuyó bajo tratamientos crónicos (AβTG2 24h: 30 ± 5%). Nuestros análisis in silico mostraron que el dominio catalítico de TG2 puede interactuar con el péptido Aβ en la región N-terminal (ΔG: -10.9, Kd: 9.754e-006, Energía del complejo: -1504). De forma complementaria, quisimos evaluar la expresión de TG2 frente a la inhibición parcial del complejo mitocondrial I (MCI) con el fármaco CP2 (25
mg/kg/day) en ratones APP/PS1 sintomáticos de 24 meses, tratados durante 15 meses. Observamos que CP2 fue capaz de revertir la sobrexpresión de TG2 en animales APP/PS1 en comparación a los animales no tratados. Finalmente, quisimos correlacionar estos cambios con marcadores de función mitocondrial utilizando los mismos modelos animales. Demostramos que CP2 restaura la morfología mitocondrial, y la comunicación retículo-mitocondria, utilizando reconstrucciones tridimensionales de volúmenes obtenidas por microscopía electrónica en serie. En conjunto, nuestros resultados indican que cambios en la formación de agregados de Aβ en modelos de la EA estaría asociada a un incremento de la actividad transamidante de TG2, por lo que puede ser un potencial blanco para el desarrollo de estrategias farmacológicas en el tratamiento de la EA, y respaldan adicionalmente el desarrollo de inhibidores de TG2 como una estrategia para prevenir la agregación amiloide observada en la EA. Se requerirá avanzar en estudios adicionales, que profundicen en los mecanismos que regulan la transcripción de TG2, y los elementos involucrados en la aceleración de la vía amiloidogénica durante la progresión de la EA.; Alzheimer's Disease (AD) is the primary form of dementia affecting older adults. It is characterized by progressive neuronal death in the hippocampus, cortex, and amygdala regions. It is postulated that one of the main toxic agents responsible for neurodegeneration is the toxic aggregation of β-amyloid peptide oligomers (AβOs), as they are believed to induce the major cellular events associated with this condition, such as Ca+2 dishomeostasis, mitochondrial dysfunction, and synaptic failure. TG2 is a ubiquitous enzyme whose main function is the formation of isopeptide bonds between proteins or peptides, and its catalytic site is activated in response to micromolar concentrations of Ca2+. An increase in TG2 transcription has been described in various transgenic models of AD, as well as in the cortex of AD patients. This doctoral thesis evaluated changes in TG2 levels in different AD models and the effect of TG2's transamidase function on Aβ peptide aggregation, as well as its main toxic effects on mitochondrial and neuronal function. We observed that TG2 levels in the hippocampus of 10-month-old J20 mice were increased (246 ± 17%), and transamidase activity was enhanced (159 ± 20%), compared to age-matched WT animals. There was a significant increase in TG2 expression in the total hippocampal lysate (286 ± 5%) and the mitochondrial fraction (313 ± 4%) of APP/PS1 mice, compared to age-matched WT mice. Furthermore, hippocampal neurons treated chronically with Aβ oligomers (AβOs, 0.5 μM) showed increased TG2 immunoreactivity (146 ± 17%) compared to untreated cells. We also assessed TG2's ability to promote Aβ peptide aggregation and compared it with the previously standardized "autocatalytic" formation by our research group. TG2-induced amyloid conversion followed a hyperbolic exponential kinetics and was able to induce aggregates with a mean size of 7-13 units (∼28, 40, 52 kDa) that exhibited high cytotoxicity (85 ± 3%). In contrast, autocatalytic formation followed a sigmoidal kinetics, resulting in smaller aggregates with a mean size of 7 units (∼28 kDa) and lower cytotoxicity (69 ± 3%). Acute treatment with AβTG2 induced a rapid overload of cytosolic Ca2+ (300 ± 22%) and mitochondrial Ca2+ (335 ± 43%). Using the PLA technique, we observed an increase in the IP3R/VDAC1 complex formation in neurons exposed to chronic AβTG2 treatments (220 ± 12%). Patch clamp recordings showed an increase in neuronal activity (30 min, 257 ± 14%), which decreased under chronic AβTG2 treatments (AβTG2 24h: 30 ± 5%). Our in silico analyses showed that the catalytic domain of TG2 can interact with the Aβ peptide in the N-terminal region (ΔG: -10.9, Kd: 9.754e-006, Complex Energy: -1504). Additionally, we wanted to evaluate TG2 expression in the context of partial inhibition of mitochondrial complex I (MCI) with the drug CP2 (25 mg/kg/day) in symptomatic 24-month-old APP/PS1 mice treated for 15 months. We observed that CP2 was able to reverse the overexpression of TG2 in APP/PS1 animals compared to untreated animals. Finally, we aimed to correlate these changes with mitochondrial function markers using the same animal models. We demonstrated that CP2 restores mitochondrial morphology and ER-mitochondrial communication, using three-dimensional reconstructions of volumes obtained by serial electron microscopy. In summary, our results suggest that changes in Aβ aggregation in AD models are associated with an increase in TG2 transamidase activity. This suggests that TG2 could be a potential target for pharmacological strategies in the treatment of AD and supports the development of TG2 inhibitors as a strategy to prevent amyloid aggregation observed in AD. Further studies are needed to delve into the mechanisms regulating TG2 transcription and the elements involved in accelerating the amyloidogenic pathway during AD progression.
2023-01-01T00:00:00ZActividad anticancerígena y antioxidante in vitro de polisacáridos ácidos obtenidos desde hongos pertenecientes a la familia Hymenochaetaceae asociados a bosque nativo de Chile.
http://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/9940
Actividad anticancerígena y antioxidante in vitro de polisacáridos ácidos obtenidos desde hongos pertenecientes a la familia Hymenochaetaceae asociados a bosque nativo de Chile.
Albornoz Muñoz, Verónica Agustina
El cáncer es una de las principales causas de muerte a nivel mundial. Su
padecimiento puede estar vinculado con factores hereditarios, o verse favorecido
por malos hábitos como el consumo excesivo de alcohol, de tabaco, o la
exposición prolongada a componentes químicos, entre otros factores. Estas
condiciones aumentan la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS),
desencadenando stress oxidativo, el cual produce daños en el material genético
que pueden inducir el desarrollo de cáncer. Los tratamientos convencionales
aplicados para esta enfermedad, como la quimioterapia, presentan un alto costo
monetario y un gran deterioro al estilo de vida de los pacientes; por lo que la
búsqueda de nuevos tratamientos o compuestos, naturales o sintéticos, que
puedan emplearse satisfactoriamente en el control del cáncer han despertado un
gran interés en los científicos. Los polisacáridos de origen fúngico han
demostrado presentar una amplia gama de actividades biológicas, tales como
actividad antibacteriana, hipoglucémica, inmunomoduladora, antioxidante y
anticancerígena. El nivel de actividad anticancerígena que presentan los
polisacáridos fúngicos está relacionado con sus características físicoquímicas,
incluyendo su composición monomérica y los grupos funcionales asociados a la
cadena principal de glucanos. En este trabajo se evaluará la capacidad
antioxidante y citotóxica contra líneas celulares tumorales, de los polisacáridos
ácidos de cuatro cepas fúngicas, pertenecientes a la familia Hymenochaetaceae
presente en bosques nativos del sur de Chile. Los polisacáridos ácidos serán
obtenidos desde las cepas FQ1645 (Nothophellinus andinopatagonicus),
FQ1626 y FQ1640 (Phylloporia boldo), y FQ1648 (posible Fomitiporia sp.), por
medio de una precipitación selectiva con Cetavlon. Los polisacáridos obtenidos
(NAAPs, PBAP26 y PBAP40, y APFQ48, respectivamente) fueron caracterizados
por análisis infrarrojo con transformada de Fourier (FT-IR). La actividad
anticancerígena in vitro fue determinada por análisis de citotoxicidad con MTT y
citometría de flujo. Además, la capacidad antioxidante de los polisacáridos fue
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evaluada usando los radicales libres sintéticos DPPH y ABTS. El análisis de FT IR permitió identificar la presencia de enlaces α y β-glicosídicos tanto en PBAP40
como en APFQ48; mientras que los picos correspondientes a grupos sulfatos
fueron evidenciados en NAAPs y APFQ48. Los ensayos de citotoxicidad contra
líneas celulares tumorales mostraron que tres de los polisacáridos estudiados
(NAAPs, PBAP40 y APFQ48) presentan un mayor efecto contra la línea celular
HL-60, con valores de IC50 de 767.16 µg mL-1
, 127.85 µg mL-1 y 800 µg mL-1
,
respectivamente. Por su parte, el polisacárido PBAP26 presenta una mayor
actividad citotóxica contra la línea celular tumoral HCT-116, con un valor de IC50
de 535.83 µg mL-1
. La evaluación del efecto citotóxico de los polisacáridos contra
una línea celular no tumoral permitió evidenciar que todos los polisacáridos
ácidos analizados presentan un efecto proliferante en la línea celular HGF-1,
obteniéndose valores de supervivencia mayores al 100% con las mayores
concentraciones de polisacáridos usadas. En cuanto al efecto de los
polisacáridos sobre el ciclo celular de la línea celular HL-60, se pudo observar
que todos los polisacáridos producen un aumento de eventos en la fase Sub G1,
suponiendo un efecto de arresto de células en esta fase del ciclo celular. Los
ensayos de actividad antioxidante evidenciaron que los polisacáridos ácidos de
las cuatro cepas en estudio presentan una mayor capacidad reductora del radical
DPPH en comparación con el radical ABTS; y que los polisacáridos PBAP40 y
APFQ48 presentan la mayor actividad antioxidante con valores de 24.53% y
27.31% de actividad antioxidante, respectivamente. Los polisacáridos analizados
presentan una significativa actividad anticancerígena in vitro contra las líneas
celulares empleadas, HCT-116, MCF-7 y HL-60, especialmente contra esta
última. La bioactividad presentada por NAAPs, PBAP26, PBAP40 y APFQ48
podría estar dada por la presencia de grupos funcionales como grupos sulfatos,
así como la existencia de β-glucanos.
Tesis para optar al Grado de Doctor en Ciencias, Mención Microbiología.
2022-01-01T00:00:00ZDistribución espacial de las variantes de histonas CS y su relación con los primeros ciclos replicativos de erizo de mar tetrapygus niger.
http://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/6615
Distribución espacial de las variantes de histonas CS y su relación con los primeros ciclos replicativos de erizo de mar tetrapygus niger.
Oliver Pavez, María Isabel
Post-fecundación el núcleo masculino sufre una descondensación de su cromatina. Esta reestructuración involucra un recambio de las proteínas histónicas que la conforman, produciéndose una pérdida de las histonas espermatozoide específicas (SpH) y su reemplazo por variantes de histonas CS de origen materno. En un estado intermedio de la remodelación del pronúcleo masculino de erizo de mar Tetrapygus niger se reportó la presencia de partículas nucleoproteicas híbridas, conformadas por sets incompletos de proteínas SpH y de variantes CS de origen materno. Sin embargo, no se conocía exactamente cómo se produce este recambio ni la composición de los nucleosomas de la cromatina espermática parcialmente remodelada. En consecuencia, el primer objetivo de esta Tesis Doctoral fue definir la naturaleza bioquímica de las nucleopartículas de composición mixta y poder postular un modelo de cómo ocurriría este recambio de proteínas histónicas. Con este propósito, nucleopartículas derivadas de la digestión de núcleos de cigotos en un estado intermedio de la remodelación, con nucleasa micrococal, fueron fraccionadas en un gradiente contínuo de sacarosa. Los nucleosomas de origen paterno fueron separados por inmunoadsorción con Sefarosa 4B unida a anticuerpos policlonales anti SpH y las proteínas contenidas en ellos analizadas por Western blot. Los resultados obtenidos demuestran que en un estado intermedio de la remodelación del pronúcleo masculino, los nucleosomas paternos están conformados por las SpH2A, SpH2B y dos fracciones mayoritarias de variantes CS, interactuando con un fragmento de ADN de aproximadamente 100 pb. Estos resultados permiten postular que la pérdida del tetrámero SpH H3-H4 ocurre simultáneamente con la adquisición de las variantes CS maternas, que vienen en su reemplazo para conformar el core nucleosomal de composición mixta. Además, se determinó que en este estado intermedio de la remodelación de la cromatina espermática, las variantes CS que conforman los nucleosomas híbridos se encuentran poliADPribosiladas y postulamos que la SpH2B se encontraría en su forma fosforilada.
Una vez concluída la remodelación del pronúcleo masculino ocurre la fusión de ambos
pronúcleos, fenómeno denominado amfimixis. Las SpH han desaparecido y la cromatina está conformada sólo por las variantes CS, en lo que a proteínas básicas se refiere. Esta estructuración persiste durante las tres primeras etapas de segmentación del embrión. Luego dos grupos de genes para histonas son secuencialmente expresados durante el desarrollo embrionario: las variantes de histonas tempranas hasta la eclosión de las larvas y, posteriormente, las variantes de histonas tardías. Las variantes CS persisten en la cromatina hasta estados tardíos del desarrollo, sin embargo, se desconoce su distribución espacial y temporal. Consecuentemente, el segundo objetivo planteado en esta Tesis Doctoral fue determinar la localización de las variantes CS en los distintos territorios embrionarios del erizo de mar y determinar si esta distribución se relaciona con el ADN con el cual fueron expresadas en los primeros ciclos replicativos.
Con el fin de definir el destino de las variantes CS, se realizó la inmunodetección en larvas plutei observándose que estas variantes se localizan en territorios específicos de la larva. Paralelamente se marcó el ADN replicado in vivo durante la segunda fase S,concordante con la expresión de las variantes CS, con bromodeoxiuridina (BrdU). Este ADN fue posteriormente inmunolocalizado en territorios específicos de la larva plutei.
Al confrontar esta localización con la obtenida para las variantes CS por doble marcaje y por microscopía confocal se constató que ambas señales colocalizan, es decir, que la segregación de las variantes CS a territorios definidos de la larva pluteus se realiza asociada al ADN replicado en su presencia. Consecuentemente, se postula que la segregación de las variantes CS a territorios específicos del embrión constituye una señal temprana de diferenciación.
Por otra parte, estas variantes CS se encuentran poliADPribosiladas y se ha descrito que esta modificación post-traduccional es ciclo celular dependiente y su inhibición se correlaciona con el alargamiento de las fases de replicación del ADN. Por ello se planteó como tercer objetivo de esta Tesis Doctoral estudiar el efecto directo de la inhibición de la poliADPribosilación sobre la replicación durante los primeros ciclos replicativos. Los resultados demuestran que el efecto de la inhibición de la poliADPribosilación post-fecundación es un enlentecimiento real de las fases replicativas y no el bloqueo de la replicación. Adicionalmente, se estudió el efecto de
esta inhibición en otra especie de erizo de mar Sphaerichinus granularis. Los resultados obtenidos indican que el efecto de la inhibición de la poliADPribosilación es un efecto directo sobre el proceso de replicación y que desacoplaría este proceso de los eventos de citoquinesis, sin alterar la distribución de tubulina.
Tesis para optar al grado de Doctor en Ciencias Biológicas.
2002-01-01T00:00:00ZAnálisis del mecanismo de remodelamiento nucleosomal asociado con la expresión temporal de genes de histonas alfa durante la embriogénesis temprana del erizo de mar tetrapygus niger.
http://repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/6022
Análisis del mecanismo de remodelamiento nucleosomal asociado con la expresión temporal de genes de histonas alfa durante la embriogénesis temprana del erizo de mar tetrapygus niger.
Medina Díaz, Ricardo Felipe
La regulación transcripcional en eucariontes ocurre en el contexto de la cromatina y está fuertemente influenciada por las barreras impuestas por la estructura nucleosomal. Entonces, una pregunta fundamental en biología es saber ¿cómo el genoma eucariótico es manipulado en el ambiente cromatínico?. In vivo, existe una asociación directa entre la remodelación de la estructura de la cromatina y la expresión regulada de genes eucarióticos. En la presente Tesis Doctoral se estudiaron los cambios que sufre la estructura cromatínica y las interacciones de factores de transcripción como consecuencia de la expresión de los genes de histonas tempranas en erizo de mar. Este modelo presenta grandes ventajas ya que en él es posible el estudio de los mecanismos involucrados en la regulación temporal de la expresión génica durante el desarrollo embrionario. En este sistema, luego de la fecundación, se expresan secuencialmente a distintos tiempos del desarrollo embrionario los genes de las histonas CS, histonas tempranas e histonas tardías. Durante este trabajo se clonó y secuenció el gen de la histona temprana H3 del erizo de mar Tetrapygus niger y se determinó su patrón de expresión, el cual se inicia al estado de 16 células, alcanza un máximo al estado de 128 células y luego declina al estado de larva Pluteus. Se encontró además un sitio hipersensible a DNasa I localizado en la posición –90 de la región promotora de este gen, el cual sólo se detectó cuando se observaron los máximos niveles del mRNA de la histona temprana H3. Se identificó el elemento regulador TnH3CCAAT (nt –94/–77), que incluye al sitio hipersensible a DNasa I, como el responsable de unir un complejo proteico presente al estado de 128 células y cuyo componente de unión al DNA es el factor de transcripción homeodominio CDP/cut. Se estableció un protocolo de purificación de complejos remodeladores de cromatina que pudieran tener un rol en la activación transcripcional temporal. Además, se identificó un complejo de características bioquímicas similares que incluye a CDP/cut como componente de unión al DNA, en un estado del desarrollo embrionario en el cual no se observa expresión del gen de la histona temprana H3 de T. niger. En base a estos resultados se postula un modelo que pretende explicar este cambio en el patrón de expresión de este gen en términos de complejos proteicos que contienen a CDP/cut como componente de unión al DNA y de estructura cromatínica durante el desarrollo embrionario de erizo de mar.
Se estudió también el posible rol del remodelamiento de la estructura de la cromatina espermática inmediatamente después de producida la fecundación. Este proceso requiere un remodelamiento de la estructura de la cromatina espermática y el reemplazo de las proteínas histónicas espermáticas por histonas CS de origen materno. En este período tan particular del desarrollo embrionario es necesaria una fuerte decondensación del pronúcleo masculino altamente compactado, con el fin de reestablecer la diploidía del genoma del embrión. En el presente trabajo también se describe por primera vez la presencia de una actividad remodeladora de cromatina dependiente de energía en citoplasma, pero no en núcleo, de óvulos sin fecundar. Esta actividad remodeladora de cromatina contendría como componente catalítico una subunidad relacionada a ISWI. No se detectaron proteínas relacionadas a SWI2/SNF2 tanto en citoplasma como en núcleo de óvulos sin fecundar. Estos resultados nos llevan a postular un modelo en el cual se incluye a esta actividad remodeladora de cromatina, conjuntamente con otras actividades enzimáticas y que explicarían el fenómeno de decondensación del pronúcleo masculino posfecundación.
Tesis para optar al grado de Doctor en Ciencias Biológicas.
2001-01-01T00:00:00Z