Diseño de un biorreactor para la producción de lactobacillus fermentum Uco-979C (Limosilactobacillus fermentum UCO-979C) y ácidos grasos de cadena corta por este probiótico con actividad anti-helicobacter pylori, en un sistema gástrico intestinal simulado.

Abstract

Helicobacter pylori es un patógeno que presenta un alto nivel de infectividad, aproximadamente el 50% de la población mundial está infectada. En la mayoría de los pacientes la sintomatología no se manifiesta de forma importante, pero la colonización del epitelio gástrico por este patógeno puede provocar daño tisular, desarrollar gastritis crónica y en el caso más extremo cáncer gástrico. Los tratamientos convencionales con antibióticos han visto disminuida su efectividad contra este patógeno debido a la resistencia bacteriana que se ha desarrollado a nivel genético, la baja tasa de cumplimiento del tratamiento por parte de los pacientes y, además, los efectos secundarios que causan los antibióticos, favoreciendo la disbiosis intestinal, modificando la microbiota bacteriana normal. Por lo que existe la necesidad de buscar terapias alternativas que demuestren capacidad para erradicar o inhibir la colonización de este patógeno en el epitelio gástrico, es aquí donde ha demostrado un efecto sinérgico el uso de probióticos conjuntamente con las terapias convencionales de antibióticos, así como un efecto preventivo de la infección. La cepa Limosilactobacillus fermentum UCO-979C, la cual nombraremos de aquí en adelante como Lactobacillus fermentum UCO-979C, para mantener su conexión bibliográfica con ensayos realizados anteriormente, ha demostrado alta capacidad para inhibir la colonización de H. pylori en el epitelio gástrico en ensayos in vivo e in vitro, convirtiéndose en una cepa relevante para combatir este patógeno, pues posee un 93% de capacidad de inhibir la infección por este patógeno, pero el reto de transferencia tecnológica no ha sido estudiado con anterioridad, con el fin de establecer condiciones sólidas para el escalamiento a nivel industrial. En este trabajo se ha determinado la cinética de crecimiento de L. fermentum UCO-979C en un medio convencional modificado, como lo es el caldo MRS, para ello se modificó la concentración y la fuente de carbono por fructooligosacáridos (Inulina o FOS), manteniendo a la glucosa como control positivo, además, se modificaron variables de operación como la temperatura, el pH inicial del medio de cultivo y la velocidad de agitación, todos a tres niveles. Los resultados obtenidos demostraron la incapacidad de L. fermentum UCO-979C para hidrolizar fructooligosacáridos, de esta manera poder aprovechar dicho sustrato como fuente de carbono, que estimule los procesos metabólicos para la división celular. La cepa ha aprovechado a la glucosa como fuente de carbono en el medio de cultivo, por lo que a partir de este sustrato se determinó los parámetros cinéticos relevantes para la cepa bajo condiciones óptimas de fermentación, las cuales resultaron ser 35°C, pH =6,80, concentración de glucosa en el medio de cultivo de 20 g/L y una velocidad de agitación de 100 RPM (el crecimiento celular no mostró dependencia importante con la velocidad de agitación), estas condiciones fueron evaluadas en un biorreactor batch de 50 litros, para el cual se ocuparon 30 litros de caldo de cultivo, obteniendo los siguientes parámetros cinéticos: velocidad máxima de crecimiento (µmáx) fue de 0,2567 ± 0,0174 h-1, la constante de Monod, Ks, 2,1065 ± 0,3820 g/L, tiempo de duplicación celular, 2,7002 ± 0,1955 h, rendimiento de producción de biomasa respecto al consumo de sustrato (glucosa) YX/S de 0,1181 ± 0,0012 g/g y un tiempo de adaptación de 0,3518 ± 0,0071 h. Estos parámetros permitieron establecer una ecuación de diseño para dimensionar un birreactor batch, la cual es función del tiempo de fermentación y del volumen de caldo a utilizar, siempre que el medio a emplear sea caldo MRS. El escalamiento de la cepa permitió obtener una biomasa seca con una concentración celular viable de 2,37 ± 0,03 x1014 UFC/g, lo cual representa una concentración alta respecto a los requerimientos mínimos de la FAO de 1,0x107 UFC/g de biomasa seca. Además, se realizaron ensayos in vitro para cuantificar la producción de ácidos grasos de cadena corta por fermentación de fructanos en un medio colónico simulado, empleando cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas, donde se utilizó la glucosa como control positivo y un medio sin fuente de carbono como control negativo, evaluando su viabilidad en dicho medio. Se obtuvo un incremento de las UFC/ml viable respecto del inóculo inicial a las 24 horas en inulina de 14,44 ± 1,57 %, en FOS de 9,80 ± 0,01 %, glucosa de 82,57 ± 2,65 %, para el control negativo de 5,38 ± 0,8 para lo cual un test ANOVA dio detalles del nivel de significancia, en el cual existieron diferencias significativas (p<0,05) cuando se sustituyó la fuente de carbono a una concentración de 10 g/L para cada fuente de carbono; para una concentración de carbohidratos de 30 g/L la viabilidad de la cepa en glucosa fue de 81,07 ± 1,01 %, inulina de 16,22 ± 1,34 %, FOS de 6,53 ± 1,32 % y en el control negativo de 8,62 ± 0,67 %, para el cual existen diferencias significativas (p<0,05) en la viabilidad y el recuento bacteriano cuando se sustituye la fuente de carbono. La cuantificación de ácidos grasos de cadena corta en el medio colónico simulado se obtuvo para el único ácido graso identificado, ácido acético, un valor de 5,16 ± 0,60 µmol/mL y 27,60 ± 3,43 µmol/mL, cuando la fuente de carbono es la glucosa en el medio colónico simulado a una concentración de 10 g/L y 30 g/L, respectivamente. Los resultados obtenidos permiten establecer las condiciones a las cuales se podrá obtener biomasa con alta viabilidad para L. fermentum UCO-979C, además, la producción de ácido acético por parte de esta cepa podría favorecer la homeostasis intestinal, ejerciendo un efecto inmunomodulador que podrían asociarse a diversos efectos benéficos a la salud en general, puesto que L. fermentum UCO-979C es un microrganismo probiótico que produce ácido acético en cantidades importantes, lo que la convierte en una cepa de gran relevancia.