Evaluación de la capacidad de protección temprana de la variante Thiverval del virus de la Peste Porcina clásica y del rol de CD46 durante su entrada a la célula.

Abstract

La Peste Porcina Clásica es una enfermedad viral multisistémica que afecta exclusivamente a cerdos y genera pérdidas económicas significativas. Su agente causal, el virus de la Peste Porcina Clásica, es un virus en cuya envoltura se hayan expuestas las proteínas Erns, E1 y E2, involucradas en la unión inicial y entrada a la célula. Sin embargo, es la interacción de E2 con uno o más receptores en la membrana celular lo que media la endocitosis del virus. De acuerdo a la evidencia, la proteína de membrana CD46 está implicada en este proceso, aunque se ha observado que algunas variantes virales, luego de la adaptación a cultivo celular, desarrollan mecanismos de infección independientes de esta proteína. Se desconoce si estas variantes emplean mecanismos diferentes para el ingreso a la célula y si existen modificaciones en la proteína E2 que podrían dar cuenta de este fenómeno. La vacunación constituye una alternativa viable para contener la diseminación del virus y eventualmente erradicarlo de aquellas regiones del mundo en donde aún permanece endémico. En estos contextos son ampliamente utilizadas las vacunas vivas modificadas, basadas en variantes del virus que han sido atenuadas luego de numerosos pases en cultivo. Sin embargo, se ha reportado la aparición de variantes de virulencia baja o moderada en zonas en donde se lleva a cabo una política activa de vacunación. Estas nuevas variantes favorecen la permanencia del virus en la población porcina y la generación de formas crónicas y persistentes de la enfermedad. Se cree que la presión inmunológica ejercida contra vacunas utilizadas durante muchos años, como es el caso de aquellas basadas en la cepa-China, ha contribuido a este fenómeno. Por lo tanto existe la necesidad de evaluar nuevas alternativas vacunales que sean igualmente seguras y eficaces en estos escenarios. Thiverval es una variante atenuada del virus de la Peste Porcina Clásica aprobada por la Organización Mundial de Salud Animal para la vacunación contra la enfermedad. Sin embargo, los reportes de seguridad y eficacia luego estudios in vivo con esta variante, datan de los años 70 y fueron obtenidos con técnicas desactualizadas a la fecha. Además, se desconoce si la variante puede transmitirse hacia animales no vacunados, cuál es su tasa de replicación en tejidos y órganos, y su capacidad de conferir protección clínica y virológica en un tiempo menor a 7 días luego de una dosis simple. La actualización de la información referente a esta variante y la evaluación de su capacidad de conferir protección temprana pueden favorecer el uso de vacunas basadas en esta cepa en entornos en donde se ha dificultado el control de la enfermedad. Por otro lado, se desconoce si las mutaciones que condujeron a la atenuación de esta variante generan cambios en la interacción con CD46. Este conocimiento constituye una herramienta útil para el potencial desarrollo de variantes virales que puedan ser utilizadas como vacunas, empleando métodos que modifiquen directamente el mecanismo de ingreso del virus con posible uso transversal en otras enfermedades veterinarias. Por tanto, el objetivo general de esta investigación fue evaluar la capacidad de protección temprana de la variante Thiverval del virus de la Peste Porcina Clásica y el rol de CD46 durante su entrada a la célula. Para la evaluación del efecto protector de la vacuna, dos grupos de animales fueron inmunizados con la variante Thiverval con 16 días de diferencia y se incluyó además en el estudio un grupo contacto y otro control. Todos los animales fueron desafiados con Margarita, variante altamente virulenta del VPPC, transcurridos 21 o 5 días post se replica en el organismo de manera controlada, sin generar viremia ni transmisión detectable hacia el grupo contacto. Además induce la expresión de IFN-α y la respuesta humoral contra E2 y Erns, las principales proteínas de la envoltura del virus. Los anticuerpos generados tienen capacidad neutralizante y son detectados desde el día 14 post inmunización. Se alcanza protección clínica completa contra los síntomas exacerbados de la enfermedad con solo 5 dpi. Además, la formulación controla la replicación del virus del desafío, protegiendo virológicamente a los animales. El rol de CD46 durante la infección viral fue evaluado in vitro incubando previamente las células con diluciones de un suero hiperinmune antiCD46 antes de la adición de Thiverval. Una dilución 1/20 no generó la inhibición completa de la infección por Thiverval, sin embargo, cuando se empleó la variante Margarita, el porciento de infección fue prácticamente nulo. Esto sugiere la existencia de mecanismos de ingreso independientes de CD46 luego de la atenuación. Un análisis in silico de la estructura de E2 de la variante Thiverval evidenció cómo las mutaciones en la región definida previamente como importante para la interacción con CD46 que podrían estar afectando la interacción con el receptor. Los resultados obtenidos en este trabajo demuestran la capacidad de protección temprana de la variante Thiverval contra la infección por el virus, lo cual la convierte en una alternativa atractiva para el control de la enfermedad en zonas endémicas. Además, esta investigación sienta las bases para investigar con más profundidad si las mutaciones que afectan la interacción inicial de un virus con sus receptores de entrada a la célula podrían ser responsables de su atenuación. Lo anterior abriría las puertas a la posibilidad de crear artificialmente variantes atenuadas con fines vacunales usando una aproximación basada en estructura proteica y la alteración la interacción del virus con su receptor natural.

Classical Swine Fever is a multisystemic viral disease that exclusively affects pigs and generates significant economic losses. Its causative agent, the Classical Swine Fever virus, is a virus that exposes in its envelope the Erns, E1 and E2 proteins, which are involved in the initial union and entry into the cell. However, it is the interaction of E2 with one or more receptors on the cell membrane that mediates endocytosis of the virus. According to the evidence, the CD46 membrane protein is involved in this process, although it has been observed that some viral variants, after adaptation to cell culture, develop infection mechanisms independent of this protein. It is unknown if these variants use different mechanisms to enter the cell and if there are modifications in the E2 protein that could account for this phenomenon. Vaccination is a viable alternative to contain the spread of the virus and eventually eradicate it from those regions of the world where it remains endemic. In these contexts, modified live vaccines are widely used, based on virus variants that have been attenuated after numerous passages in culture. However, the appearance of variants of low or moderate virulence has been reported in areas where an active vaccination policy is carried out. These new variants favor the permanence of the virus in the swine population and the generation of chronic and persistent forms of the disease. It is believed that the immunological pressure exerted against vaccines used for many years, such as those based on the China-strain, has contributed to this phenomenon. Therefore, there is a need to evaluate new vaccine alternatives that are equally safe and effective in these scenarios. Thiverval is an attenuated variant of the Classical Swine Fever virus approved by the World Organization for Animal Health for vaccination against the disease. However, the safety and efficacy reports after in vivo studies with this variant date back to the 1970s and were obtained with techniques that are outdated to date. In addition, it is unknown whether the variant can be transmitted to non-vaccinated animals, its replication rate in tissues and organs, and its ability to confer clinical and virological protection in less than 7 days after a single dose. Updating the information regarding this variant and evaluating its ability to confer early protection may favor the use of vaccines based on this strain in settings where disease control has been difficult. On the other hand, it is unknown if the mutations that led to the attenuation of this variant generate changes in the interaction with CD46. This knowledge constitutes a useful tool for the potential development of viral variants that can be used as vaccines, using methods that directly modify the virus entry mechanism with possible cross-sectional use in other veterinary diseases. Therefore, the general objective of this research was to evaluate the early protection capacity of the Thiverval variant of the Classical Swine Fever virus and the role of CD46 during its entry into the cell. To assess the protective effect of the vaccine, two groups of animals were immunized with the Thiverval variant 16 days apart, and a contact group and a control group were also included in the study. All the animals were challenged with Margarita, a highly virulent CSFV variant, at 21- or 5-days post immunization (dpi). The results of this study show that the Thiverval variant has a low replication rate in the organism and that it is not transmitted to the contact group. It also induces the expression of IFN-α and the humoral response against E2 and Erns, the main proteins of the virus envelope. Neutralizing antibodies are detected from day 14 post immunization and clinical protection against exacerbated symptoms of the disease is achieved with only 5 dpi. In addition, the formulation controls viral replication after challenge, virologically protecting the animals. The role of CD46 during viral infection was assessed in vitro by pre-incubating cells with dilutions of an anti-CD46 polyclonal serum prior to the addition of Thiverval. A 1/20 dilution did not generate complete inhibition of Thiverval infection, however, when the Margarita variant was used, the infection rate was practically nil. This suggests the existence of CD46-independent entry mechanisms after attenuation. An in-silico analysis of the E2 structure of the Thiverval variant showed how the presence of mutations in the region previously defined as important for the interaction with CD46 could be affecting the interaction with the receptor. The results obtained in this work demonstrate the early protection capacity of the Thiverval variant against infection by the virus, which makes it an attractive alternative for the control of the disease in endemic areas. In addition, this research lays the groundwork for further investigation of whether mutations that affect a virus's initial interaction with its cell-entry receptors could be responsible for its attenuation. This would open the doors to the possibility of artificially creating attenuated variants for vaccine purposes using an approach based on protein structure and altering the interaction of the virus with its natural receptor.