Rol de IIIG9 en la mantención de uniones adherentes y la polaridad de células ependimarias normales.

Abstract

IIIG9 (PPP1R32/SAXO4) es la subunidad regulatoria 32 de la proteína fosfatasa-1 (PP1) de la cual existe escasa información sobre su función. En el sistema nervioso central (SNC) adulto, presenta una localización restringida a cilios móviles, en las uniones adherentes y el citosol de las células ependimarias. Reportes preliminares de esta tesis indicaron que la inhibición in vivo de IIIG9 en la pared ventricular adulta genera denudación ependimaria parcial y presencia de células no polarizadas que internalizan las cadherinas. Sin embargo, hasta la fecha se desconoce un mecanismo molecular que explique la acción de IIIG9 en los complejos proteicos que estabilizan las uniones adherentes. Además, es desconocida la relevancia de IIIG9 en la mantención de las uniones adherentes en las células progenitoras de la pared ventricular, llamadas glias radiales (RGC), y sus efectos en la formación de neuronas y otros tipos de células gliales, como astrocitos. En esta tesis postulamos que IIIG9 forma un complejo con la proteína fosfatasa-1 alfa y Par-3 (proteína de polaridad celular), promoviendo la mantención de las uniones adherentes durante la polarización y diferenciación de las células ependimarias. En el primer objetivo determinamos que IIIG9 se induce tempranamente en el periodo embrionario (E11), con una distribución polarizada hacia el cuerpo de la glia radial, junto a las cadherinas, PP1 alfa y Par-3. La distribución polarizada de estas proteínas se mantiene en la etapa postnatal (PN) y en el epéndimo adulto. Mediante análisis de inhibición in vivo en animales embrionarios (inyección adenoviral en E16 y análisis en cerebros PN4) reportamos un fenotipo de heterotopia ventricular, representado por cúmulos celulares que expresan marcadores de diversos linajes (glias radiales, precursores neurales y gliales). Este efecto fue acompañado de cambios en el patrón de distribución de las cadherinas respecto a la condición control. En zonas marginales de la corteza cerebral, se observaron cúmulos celulares sugiriendo la presencia de heterotopia cortical, rodeada de astrogliosis reactiva. Además, se observa una reducción del área inmunoreactiva para GFAP que sugiere una reducción en la población de astrocitos marginales. En nuestro segundo objetivo, reportamos la interacción entre IIIG9/E-cadherina, IIIG9/PP1 y Par-3/E-cadherina a nivel de los cilios y las regiones basolaterales de las células ependimarias. Similar a lo que observamos en un modelo in vitro de células MDCK polarizadas. Finalmente, mediante análisis de FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) determinamos la interacción entre IIIG9 y PP1 alfa en células HEK292T. En conclusión, nuestros hallazgos indican que IIIG9 (PPP1R32/SAXO4) promueve la mantención de la polaridad de la glía radial (célula troncal) y de las células ependimarias, a través de las uniones adherentes. Esta función podría ser dependiente de la interacción de IIIG9 con cadherinas, PP1y posiblemente con Par-3. Así la correcta función de IIIG9 podría limitar la aparición de patologías del desarrollo cerebral como la dislexia, la epilepsia, el autismo, entre otras; y del cerebro adulto como la hidrocefalia.

IIIG9 (PPP1R32/SAXO4) is the regulatory subunit 32 of protein phosphatase-1 (PP1), with limited functional information. In the adult CNS, this protein specifically localizes to motile cilia, adherens junctions and ependymal cells cytosol. Preliminary reports of this thesis indicated that in vivo inhibition of IIIG9 in the adult ventricular wall generates partial ependymal denudation and the presence of non-polarized cells that internalize cadherins. These findings indicate that IIIG9 plays a crucial role in maintaining adherens junctions in ependymal cells; however, a molecular mechanism explaining its key role in the stabilization of these junctions has not been reported to date. Additionally, the significance of IIIG9’s maintenance role is currently unknown for ventricle wall progenitor cells, known as radial glias, nor during the formation of neurons and other types of glial cells, such as astrocytes. In this thesis, we postulate that IIIG9 forms a complex with PP1 (protein phosphatase 1 alpha) and Par-3 (a cell polarity protein), contributing to the maintenance of adherens junctions during the polarization and differentiation of ependymal cells. In the first objective, we report that IIIG9 is induced early at the embryonic stage (E11), having a polarized distribution towards the body of the radial glia, along with cadherins, PP1 and Par-3. This polarized distribution is maintained during the postnatal stage and in the adult ependyma. Through in vivo inhibition analysis in embryonic animals (adenoviral injection at E16 and analysis in PN4 brains) we report a phenotype of ventricular heterotopia, represented by cell clusters that express markers of various lineages (radial glia, neural and glial precursors). In these animals, we observe changes in the distribution pattern of cadherins compared to the control. In marginal zones of the cerebral cortex, cell clusters were observed, suggesting the presence of cortical heterotopia, surrounded by reactive astrogliosis. Moreover, it was observed a reduction in the immunoreactive zone for GFAP, suggesting a drop in the marginal astrocyte population. In our second objective, we report the interaction between IIIG9/E-cadherin, IIIG9/PP1 and Par-3/E-cadherin at the ciliary level and on the basolateral regions of ependymal cells. These observations were similar to the polarized model of MDCK cells in vitro. Finally, using FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) we inform the interaction between IIIG9 and PP1 in HEK292T cells. In conclusion, our findings indicate that IIIG9 (PPP1R32/SAXO4) promotes the maintenance of radial glial (troncal cell) and ependymal cell polarity, via adherens junctions. This function could depend on the interaction of IIIG9 with cadherins, PP1 and possibly with Par-3. The correct functioning of IIIG9 could be a key factor in limiting the emergence of brain development pathologies such as dyslexia, epilepsy, autism, during development, and at the adult brain such as hydrocephalus.