Regulación de la expresión de receptores de glicina mediada por la activación o inhibición de la proteína quinasa dependiente de ciclina 5 (Cdk5)

Abstract

La quinasa dependiente de ciclina 5 (Cdk5) es una enzima que fosforila residuos de serina o treonina dirigidos por prolina. Cdk5 participa en diferentes etapas del desarrollo del sistema nervioso y está mayoritariamente activa en neuronas post-mitóticas, debido a la alta expresión de sus activadores p35 y p39. Estudios anteriores han reportado que Cdk5 puede modificar la actividad de canales iónicos y receptores neuronales mediante fosforilación. Sin embargo, la posibilidad de que Cdk5 module los receptores inhibitorios de glicina (RGlis) aún no ha sido explorada. Los RGlis pertenecen a la familia de canales iónicos activados por ligando y median la entrada del ion cloruro a la neurona, generando una hiperpolarización del potencial de membrana y un control efectivo de la excitabilidad neuronal. Estudios preliminares de nuestro grupo indican que en el dominio intracelular de las subunidades α1, α2 y β de RGli hay potenciales sitios consenso de fosforilación mediada por Cdk5. Estos análisis mostraron que la subunidad β posee un sitio de consenso canónico para fosforilación por Cdk5 (391TPVH), mientras que la subunidad α1 y α2 solo posee un motivo mínimo de serina/treonina guiada por prolina (408SP y 392TP respectivamente). A través de ensayos de inmunofluorescencia, se analizó el efecto de la activación o inhibición de Cdk5 sobre la expresión y localización subcelular de los RGli recombinantes (de configuración α1, α1β, α2β, α3β) así como RGli nativos en cultivos primarios de neuronas espinales. Nuestros análisis mostraron que la activación de Cdk5 no afecta la expresión de RGli recombinantes compuestos por la subunidad α1 y α3β. De manera contraria, se observó un aumento significativo (del 33%) en la expresión los RGli heteroméricos (α1β o α2β) al activar Cdk5 mediante la sobreexpresión de p35 en células HEK293. Por otro lado, al analizar la inhibición de Cdk5 con roscovitina (30 μM), este aumento de expresión se ve bloqueado. Los estudios en cultivos primarios espinales mostraron que, la activación de Cdk5 disminuye la expresión de RGli (50%). Sin embargo, al inhibir la actividad de esta quinasa, no se observaron variaciones en la expresión de este receptor. En resumen, nuestros resultados indican que la expresión y localización de los RGli heteroméricos (α1β o α2β) podrían ser regulados por Cdk5, probablemente mediante fosforilación de la subunidad β, lo que podría tener implicancias importantes en el control glicinérgico de la excitabilidad neuronal.

Cyclin-dependent kinase 5 (Cdk5) phosphorylates proline-directed serine or threonine residues. Cdk5 participates in different stages of nervous system development and is mainly active in post-mitotic neurons, due to the high expression of its p35 and p39 activators. Previous studies have reported that Cdk5 can modify the activity of ion channels and neuronal receptors through phosphorylation. However, the possibility that Cdk5 modulates inhibitory glycine receptors (GlyRs) has not yet been explored. GlyRs belong to the family of ligand-gated ion channels and mediate chloride ion entry into the neuron, generating a hyperpolarization of the membrane potential and effective control of neuronal excitability. Preliminary studies from our group indicate that in the intracellular domain of the α1, α2, and β subunits of GlyR, there are potential consensus phosphorylation sites mediated by Cdk5. These analyses showed that the β subunit has a canonical consensus site for Cdk5 phosphorylation (391TPVH), while the α1 and α2 subunits only have a minimal proline-directed serine/threonine motif (408SP and 392TP, respectively). Through immunofluorescence assays, the effect of Cdk5 activation or inhibition on the expression and subcellular localization of recombinant GlyRs (α1, α1β, α2β, α3β) as well as native GlyRs in primary spinal neuron cultures was analyzed. Our analyses showed that Cdk5 activation does not affect the expression of recombinant GlyRs composed of the α1 and α3β subunits. In contrast, a significant increase (of 33%) in the expression of heteromeric GlyRs (α1β or α2β) was observed when Cdk5 was activated by overexpressing p35 in HEK293 cells. On the other hand, when Cdk5 was inhibited with roscovitina (30 μM), this increase in expression was blocked. Studies in primary spinal cultures showed that Cdk5 activation decreases GlyR expression (50%). However, inhibiting the activity of this kinase did not lead to any variations in receptor expression. In summary, our results suggest that the expression and subcellular localization of heteromeric GlyRs (α1β or α2β) may be regulated by Cdk5, possibly through phosphorylation of the β subunit, which could have significant implications for the glycinergic control of neuronal excitability.