Identificación y evaluación de genes asociados al sistema profenoloxidasa de Caligus rogercresseyi y su respuesta transcriptómica frente a los antiparasitarios deltametrina, cipermetrina y azametifos.

Abstract

El sistema profenoloxidasa (porPO) es esencial para inducir la melanización. Este proceso implica la síntesis rápida de melanina en el sitio de infección y lesión. Además de su papel en la inmunidad innata, el sistema proPO también es importante en procesos como la esclerotización de la cutícula y por consiguiente posee un rol clave en la respuesta a pesticidas. Por estos antecedentes, sumado a una pérdida y a su vez diferencia en la efectividad de los tratamientos contra el copépodo ectoparásito Caligus rogercresseyi, que uno de los objetivos de este estudio fue el identificar genes del sistema proPO, además de su relación con la respuesta inmune en invertebrados, su rol en procesos como esclerotización de la cutícula y respuesta frente a pesticidas. De esta manera se evaluó la modulación de este sistema frente tres antiparasitarios: azametifos, deltametrina y cipermetrina. Información obtenida por secuenciación masiva de transcriptomas desde cuatro etapas de desarrollo de C. rogercresseyi, ocho transcritos involucrados en el sistema proPO fueron identificados. Los niveles de expresión fueron analizados mediante RNA-seq y posteriormente validados por RT-qPCR. Se observaron patrones similares de expresión génica para los transcritos anotados de Factor activador de Profenoloxidasa I y II, homólogo de serina proteasa 1 y masquerade frente a cipermmetrina y deltametrina. Fenoloxidasa presento un patrón similar frente a azametifos y cipermetrina (sobreexpresada), mientras que en profenoloxidasa presento una sobreexpresión frente a azametifos y deltametrina. Un segundo objetivo de esta investigación fue el identificar SNPs en genes previamente descritos que están relacionados con la respuesta transcriptómica de C. rogercresseyi frente a antiparasitarios, además de evaluar su expresión en respuesta a azametifos, deltametrina y cipermetrina. Por último se realizó una comparación mediante RNA-seq con datos de secuenciación de individuos provenientes de zonas donde se observó diferencias en la efectividad de estos antiparasitarios. Con respecto a la identificación de SNP, se lograron detectar 18 SNPs en total en la región codificante de las secuencias de los genes analizados. Entre los SNPs identificados se observaron 10 transversiones y 8 transiciones. Del análisis in silico y de RT-qPCR, se observó que el transportador de Na-K fue sobre expresado frente a azametifos y cipermetrina; prohibitina 2 fue sobreexpresado frente a deltametrina y suprimido frente a los demás antiparasitarios. A cerca de carboxilesterasa este es sobre expresada frente a deltametrina y suprimida en su expresión frente a azametifos y cipermetrina, mientras que P-gp es sobre expresado frente a estos últimos antiparasitarios y suprimida frente a deltametrina. Por otra parte el receptor neuronal de acetilcolina (nACh) es suprimido frente a azametifos; tropomiosina es sobre expresado solo en respuesta a azametifos mismo patron observado en transportador ABC_C; con respecto a colágeno alfa este es sobre expresado frente a los piretroides. Por otra parte glutatión-s-transferasa es sobre expresado frente a los tres antiparasitarios; mientras que quitinasa es suprimido. Además, se observa que en el caso de citocromo P-450, este solo es sobre expresado frente a cipermetrina. Por último, acetilcolinesterasa (AChE) muestra una supresión frente a azametifos y cipermetrina. En relación al análisis transcriptómico de C. rogercresseyi provenientes de distintas regiones se observó que en el caso de los individuos desafiados con azametifos presentan variaciones en los niveles de expresión entre poblaciones. Con respecto al caso de los C. rogercresseyi desafiados con deltametrina, se observa que gran parte de los genes analizados presentan diferencias en los niveles de expresión entre regiones. Sin embargo AChE y nACh, genes blancos de azametifos no evidencian diferencias de expresión entre regiones. En resumen se sugiere que estas variaciones se explicarían debido a la presencia de los SNP presentes en los individuos provenientes de la XI región los cuales no están presentes en los individuos de la X región. Además, estos resultados proporcionan información para comprender las diferencias en efectividad de los tratamientos entre diferentes zonas, información con la cual se logra entregar nuevas aproximaciones para la comprensión de la resistencia farmacológica de este ectoparásito.