Plásmidos relacionados a blaKPC en cepas de enterobacterias chilenas productoras de carbapenemasas.

Abstract

Klebsiella pneumoniae es uno de los bacilos Gram negativos resistentes a antibióticos más frecuentemente aislados de infecciones asociadas a atención en salud en Chile. A nivel mundial, la mayor morbimortalidad se presenta con las cepas que sintetizan carbapenemasas que inactivan los antibacterianos utilizados como última línea de tratamiento. Desde la primera detección de un aislado de K. pneumoniae productor de la carbapenemasa KPC, en 1996 en Carolina del Norte, la distribución geográfica de esta enzima y su hospedador se ha ampliado de forma alarmante. En Chile no se había informado casos de infecciones por enterobacterias productoras de esta carbapenemasa hasta marzo del año 2012, cuando se aisló una cepa de K. pneumoniae en un paciente proveniente de Italia. Posteriormente, se comienza a informar aislamientos autóctonos de diversas especies de la familia Enterobacteriaceae productores de KPC-2. Hasta el momento no se dispone de información sobre los plásmidos en donde se encuentra el gen codificante de la enzima KPC-2 en las cepas aisladas en Chile. Por lo tanto, el objetivo de esta tesis fue identificar y determinar el grupo de incompatibilidad de los plásmidos en los cuales está localizado el gen blaKPC-2 en las primeras cepas de enterobacterias aisladas en hospitales chilenos. Se trabajó con 8 cepas de enterobacterias productoras de KPC-2, aisladas en diferentes centros hospitalarios entre los años 2012 y 2014, proporcionadas por el Instituto de Salud Pública de Chile. Las cepas fueron seleccionadas de acuerdo a la especie bacteriana (K. pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens) y las 4 cepas de K. pneumoniae de acuerdo al secuenciotipo y ambiente genético en que se encuentra el gen blaKPC-2. En primer lugar, empleando ADN total se realizó un screening de los grupos de incompatibilidad de los plásmidos contenidos en cada cepa mediante el método de tipificación de replicón basado en PCR. Luego se extrajo el ADN plasmídico con el kit comercial DNA Zyppy Plasmid Miniprep® y el plásmido portador del gen blaKPC-2 fue investigado por el método de transferencia alcalina e hibridación por Southern blot. Las bandas plasmídicas que hibridaron con la sonda marcada fueron cortadas desde el gel de agarosa para obtener el ADN correspondiente. La presencia del gen blaKPC-2 fue verificada por PCR y luego se detectó el grupo de incompatibilidad de los plásmidos. Los productos de PCR del análisis de los grupos de incompatibilidad fueron enviados a secuenciar a MacroGen, Korea. Se encontró que 7 de los 8 aislados presentaron más de un tipo de plásmido y la mayor diversidad de plásmidos fue encontrada en la cepa de E. coli UC327 (IncFIB, IncA/C, IncN e IncY). Mediante Southern blot se estableció que el gen blaKPC-2 está localizado en un plásmido de tamaño 146 Kb, perteneciente al grupo de incompatibilidad IncF en las cepas de E. coli UC327, K. pneumoniae UC338 y E. cloacae UC347 y, específicamente, de la variante IncFIB en E. coli y E. cloacae. El plásmido que porta blaKPC-2 en la cepa K. oxytoca se pudo aislar, y correspondió a un plásmido no tipificable. Se destaca que el plásmido de la cepa E. coli presenta dos sistemas de replicación, IncFIB e IncN, es decir, es un plásmido de la categoría multireplicón. Las secuencias de los replicones de los grupos de incompatibilidad IncFIB de las cepas de E. coli y E. cloacae, evidenciando la misma identidad en cepas de diferentes especies. Se concluye que el gen blaKPC-2 se localiza, principalmente, en variantes de plásmidos del grupo de incompatibilidad F de un tamaño de ca. 146 Kb, en cepas de enterobacterias correspondientes a los primeros casos detectados en Chile. Esta tesis aporta con la primera información, aunque limitada, de la identidad de plásmidos portadores del gen que codifica para la carbapenemasa KPC-2 en cepas chilenas de enterobacterias.