Caracterización estructural de una proteína de unión γ 33 asociada a la R-ficoeritrina de Gracilaria chilensis (Rhodophyta: racilariaceae).

Abstract

Los ficobilisomas (PBS) son complejos proteicos accesorios captadores de luz, constituídos principalmente por ficobiliproteinas (PBPs). La luz absorbida por las PBPs es eficientemente transferida a los centros de reacción fotosintética mediante bilinas o cromóforos que se encuentran covalentemente unidos a residuos específicos de cisteínas. Además de las ficobiliproteínas, el PBS contiene proteínas de unión responsables del ensamblaje y la estabilización de todo el complejo y el ajuste de los pasos de transferencia de energía entre los cromóforos. La proteína de unión cromoforilada (γ33) de Gracilaria chilensis, es un linker de varillas que se encuentra asociada a hexámeros (αβ)6 de R-ficoeritrina (R-PE). Debido a que su rol en el proceso de transferencia de energía aún no está claro, estudios con enfoques estructurales podrían ayudar a entender dicho proceso. Inicialmente, se realizó el clonamiento y secuenciación del gen codificante de la subunidad γ33. La secuencia proteica fue analizada luego de su traducción in silico, en la que se determinó que la proteína consta de 318 residuos aminoacídicos incluyendo un péptido de tránsito cloroplástico (cTP) de 39 aminoácidos en el extremo N-terminal. Se realizaron análisis espectroscópicos del linker purificado a partir de R-PE y mediante espectrometría de masas se confirmó su secuencia. Usando subunidades α y β R-PE como sondas espectroscópicas en ensayos de denaturación, se dedujo la existencia de una ficourobilina (PUB) unida a dos residuos Cis en la subunidad γ33, y luego el análisis de espectrometría de masas permitió confirmar los sitios de unión en las Cis62 y Cis73 (DL-PUB62/73). El análisis del espectro de absorción del ensayo de denaturación, en conjunto con la determinación de las áreas de los máximos de absorción, indican igual proporción PUB/PEB. Adicionalmente, datos obtenidos a partir de ensayos de entrecruzamiento químico acoplado a espectrometría de masa, difracción de rayos X junto con datos de crio-tomografía electrónica (Cryo-ET) del complejo R-PE se integraron para corregir y reconstruir un modelo de γ33 previamente obtenido a través de modelamiento por homología. La subunidad γ33 presenta dos repeticiones internas con nueve hélices α (H1-H9) entre ellas. El extremo N-terminal consta de un bucle largo con dos pequeñas α-hélices (N, N ’). Las repeticiones internas hacen contactos extensos con cierto estilo simétrico en la región interna del hexámero de R-PE. Las α-hélices H1, H2 y H3/H4 contactan con tres lados internos del mismo trímero (T1R-PE): en la α-hélice X de las subunidades α, y F y F’ de las subunidades β. El bucle que separa las α-hélices H1 y H2 interactúa principalmente con la hélice X de la subunidad α del trímero opuesto (T2R-PE). Las α-hélices H6, H7 y H8/H9 entran en contacto con tres lados internos del mismo trímero T2R-PE: en la α-hélice X de las subunidades α, y F y F’ de las subunidades β, como H1, H2 y H3/H4 en T1R-PE. El extremo N-terminal de la subunidad γ33 contiene un bucle largo que se repliega hacia la región de repetición que junto con una α-hélice corta (N’) sobresale ligeramente hacia el exterior de la cavidad y podría insertarse en el hexámero contiguo. El cromóforo unido a Cis-259 es una propuesta a partir de datos cristalográficos, y su entorno mantiene las características fisicoquímicas similares a los cromóforos asociados a α y β de otras PBPs, aunque con variaciones en los aminoácidos constituyentes que podrían explicar los sutiles cambios en las propiedades espectrales. Las cisteínas involucradas en la doble unión de la PUB se encuentran ubicadas en una región helicoidal en una conformación que recuerda la posición del DL-PUB50/61 en la subunidad β de R-PE.