La competencia de embriones bovinos producidos in vitro modifica la señalización embrionaria mediada por vesículas extracelulares.

Abstract

Las vesículas extracelulares (EVs) secretadas por los blastocistos pueden ser relevantes, como un buen predictor de la competencia de los embriones producidos in vitro. El objetivo de este trabajo fue determinar el perfil de mi ARN contenido en EVs secretadas por embiones bovinos con diferente velocidad de desarrollo in vitro y competencia pre-implantatoria. El trabajo fue abordado con dos experimentos. El primer experimento fue para identificar y caracterizar las EVs secretadas por embiones bovinos pre-implantatorios. Para esto se consideró la secreción durante la etapa de desarrollo posterior a la blastulación (día 7-9 de desarrollo in vitro) y se incluyeron solo embriones protuidos para eliminar el efecto de la zona pelúcida. Además, se consideraron embiones producidos in vitro utilizando dos tecnologías que producen embiones con diferente competencia: 1) partenogénicos (PA), menos competentes y 2) fecundación in vitro (IVF), más competentes. Un segundo experimento fue para realizar una determinación no invasiva de competencia embionaria considerando características de poblaciones de EVs secretadas durante la etapa de blastulación y parámetros morfocinéticos del embrión. Para esto, los embriones fueron cultivados en grupos, hasta el día 5 de desarrollo in vitro, en este momento se seleccionaron las mórulas, las cuales se cultivaron individualmente en SOFaa depletado hasta el día 7.5. Durante este periodo los embriones fueron monitoreados para determinar el momento de la aparición del blastocele, como indicador cinético de desarrollo embrionario: 1) blastulación temprana (EB: Día 6.5) y 2) blastulación tardía (LB: Día 7.5). Al día 7.5, se determinaron las características morfológicas de los blastocistos siguiendo los criterios de la IETS. Al día 7.5, se colectó individualmente el medio de cultivo, se identificó con el embrión correspondiente y se conservó a -80 °C para posteriores análisis.Los blastocistos evaluados (día 7.5) fueron transferidos a medio SOFaa dep fresco hasta el día 11 de desarrollo in vitro para determinar su potencial de desarrollo post-eclosión, de acuerdo a su crecimiento. A los parámetros tamaño y concentración de EVs generados por Nano Tracking Analysis (NTA), se les realizó análisis de varianza y la comparación de medias test HSD. Posteriormente, las variables de morfología del blastocisto y características morfológicas de las EVs fueron sometidas a análisis de componentes principales (PCA) y análisis de conglomerados (CA) para la posibilidad de discriminar los grupos de embiones. Finalmente, se utilizó un análisis de regresión logística binaria, para construir modelos no invasivos de predicción de competencia embrionaria. El análisis estadístico se realizó con el programa SAS versión ocho para Windows y programa IBM SPSS Statistics versión 19. En el experimento 1, el análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM) reveló la presencia de vesículas heterogéneas de diferentes tamaños y población: microvesículas (MVs) y exosomas (Exs) de forma redondeada, encerrados por una capa doble de lípidos y con un rango de 30 a 385 nm de diámetro. Además, el análisis de citometría de flujopermitió identificarproteínas de superficie CD63 y CD9 como marcadores de EVs. El NTA generó datos sobre las características morfológicas de las EVS, tamaño y concentración. El perfil (concentración y tamaño) de partículas secretadas por embriones derivados de IVF, fue diferente a las secretadas por embriones PA. En el experimento 2, las características morfológicas de los blastocistos se diferenciaron estadísticamente de acuerdo con el momento de blastulación y competencia por su tamaño y calidad. Los embriones más competentes del grupo de blastulación temprana secretaron EVs con mayor tamaño (122.9 nm), mientras que la mayor concentración de EVs (5,75 x 10 [9] partículas / ml) correspondió al grupo no competente. La secuenciación de ARN pequeños mostró un total de dos biotipos, miARN (86 a 91%) y snoARN (9 a 14%). Además, se identificó un total de 182 miARN y 31 snoARN. El análisis de expresión diferencial de miARN entre blastocisto competente versus no competente, mostró 12 miARN regulados positivamente y 15 miARN regulados negativamente. Posteriormente, utilizando una regresión logística binaria, se construyó un modelo no invasivo para predecir la competencia embrionaria basada en una combinación de variables morfocinéticas de blastocisto y las características de EVs los cuales mostraron un alto ROC-AUC de 0.853. En conclusión, en este trabajo se demostró que los blastocistos bovinos secretan MVs/EXs a los medios de cultivo y esta secreción tiene características que varía dependiendo de la competencia embrionaria previa a la implantación, por lo tanto, es posible generar un nuevo modelo predictivo no invasivo de alta eficiencia para la selección de embriones bovinos.