Resumen:
La forma predominante de la vitamina C en el plasma es el ácido ascórbico, el cual es transportado al interior de las células por cotransportadores de Na+-ascorbato denominados SVCTs. SVCT1 ha sido clonado molecularmente y caracterizado funcionalmente, caracterizándose por presentar una Km aparente de transporte de ácido ascórbico en el rango de 100-150 μM y ser activado cooperativamente por Na+.
Recientemente hemos construido un modelo 3D de SVCT1 que propone un modelo de plegamiento conteniendo 14 segmentos transmembrana (STM) agrupados en un canal
central, constituido por 6 STM (1, 2, 3, 8, 9 y 10) que contienen el poro de transporte y
también los sitios de unión para Na+ y ácido ascórbico el cual estaría rodeado por 4 STM
accesorios (4, 5, 11 y 12). Además, el modelo propone un dominio compuerta, el cual
está formado por los STM 6, 7, 13 y 14, los cuales se encuentran en directa interacción
con la membrana celular pero no se les ha asignado un papel importante en determinar las
características funcionales de SVCT1.
A raíz que actualmente no existe información que permita relacionar la estructura de SVCT1 con su función, hemos realizado un análisis de secuencia entre SVCT1 y proteínas ortólogas y parólogas con el fin de encontrar residuos aminoacídicos que pudieran resultar importantes para su función. De especial interés es encontrar residuos aminoacídicos que participen en la unión de los sustratos y que definan su función para poder definir posibles blancos terapéuticos a futuro. En base a esto, se propuso como hipótesis de trabajo que los STM 1, 2, 4, 8, 10 y 11 forman parte del poro en el cotransportador de Na+-ascorbato SCVT1. En este contexto, propusimos que los residuos aminoacídicos H51 en STM 1, S80 en STM 2, I170 y G171 en STM 4, V321, L322 y S335 en STM 8, T375, G378, S379, S381 y S382 en STM 10 y T417 y A418 en STM 11
son elementos estructurales importantes en el dominio de unión de sustratos en SVCT1, y
por lo mismo su reemplazo no conservado a través de mutagénesis sitio-dirigida tendrá
efectos deletéreos en la función del transportador de ácido ascórbico SVCT1.
En esta tesis se desarrolló un estudio de mutagénesis detallado con el objetivo de establecer la relación estructura-función y las propiedades regulatorias del dominio central, además de algunos residuos aminoacídicos localizados en el dominio compuerta y en lazos exofaciales.
Cada una de las proteínas mutantes generadas fue expresada como una proteína de fusión
con la proteína fluorescente verde (GFP) en células HEK-293. La localización subcelular
se analizó por microscopía confocal utilizando cortes ópticos sucesivos a lo largo del eje
z de la célula y corroborada por estudios de coexpresión con GLUT1 fusionado a la
proteina fluorescente roja (DsRed) como marcador de membrana celular.
Además, se realizaron ensayos de transporte de ácido ascórbico marcado radiactivamente para determinar el efecto de las mutaciones sobre las propiedades cinéticas del transporte
de ácido ascórbico (Km y Vmax) y sobre el efecto cooperativo del Na+. Estos experimentos
revelaron que el total de las mutaciones realizadas en STM pertenecientes al canal central
(poro y hélices accesorias) sufrió cambios que incluyen la retención intracelular, cambios
en las constantes cinéticas e incluso la pérdida total en la capacidad de transportar ácido
ascórbico. Como era esperable, las mutaciones en las hélices compuerta o en lazos exofaciales no afectaron drásticamente la función y localización del transportador, con algunas excepciones donde se vieron principalmente alteraciones en el efecto cooperativo del Na+.