Participación de proteínas-G en el proceso de maduración inducido por progesterona en ovocitos de xenopus laevis.

Abstract

La hormona progesterona induce el proceso de maduración meiótica del ovocito de Xenopus laevis a través de un mecanismo de acción no genómico, el cual se caracteriza por ser un evento rápido en el tiempo y que involucra la inhibición del sistema efector adenilil ciclasa (AC). La participación de proteínas G en el proceso de maduración se basa principalmente en el hecho que el efecto inhibidor del esteroide es dependiente de GTP. Sin embargo, hasta el momento la identidad de la proteína G involucrada en este proceso no ha sido definida de manera directa, aunque posiblemente Gs sería el modulador involucrado. Recientemente se ha postulado que el heterodímero G de la proteína G también estaría directamente involucrado en el control del proceso de maduración, manteniendo activa la AC en forma constitutiva y por lo tanto bloqueando la entrada del ovocito a la transición G2/M del ciclo celular. Ha sido propuesto que progesterona actúa interfiriendo con la activación de la AC por Gs y G . En este trabajo de tesis se estudió cómo los cambios en los niveles de Gs afectan el proceso de maduración inducido por progesterona. Se encontró que la sobre expresión en el ovocito de la Gs silvestre de X. laevis y de la mutante constitutivamente activa GsQL, bloquearon la maduración inducida por progesterona, siendo más efectiva la mutante GsQL que la forma silvestre. Por otro lado, la depleción de la Gs endógena, utilizándose oligonucleótidos sin sentido, causó maduración espontánea del ovocito y activación de la vía MAPK. Estos resultados indican claramente que la presencia de Gs en el ovocito es necesaria para mantener el ovocito detenido en la interfase G2/M. Para analizar en mayor detalle la participación de Gs, se estudió el efecto de dos mutantes dominantes negativas para Gs. Se encontró que la mutante d-Gs acelera el proceso de maduración inducido por progesterona, y la mutante D-Gs causa maduración espontánea, sin embargo la coinyección de la subunidad G revierte el efecto inductor de la maduración de la dominante negativa, lo que indicaría que la dominante negativa estaría actuando como proteína secuestradora de G y no sería capaz de desacoplar a Gs endógena de un receptor activado. La sobre-expresión de receptores del tipo GPCR como el 2AR y los receptores muscarinícos M4 y M5, causaron una inhibición de la activación de la vía MAPK por progesterona. El efecto observado se debería a que estos receptores al ser activados por sus respectivos ligandos inducen la liberación de G desde su respectiva G, la cual junto con Gs-GTP, activan la AC. Para corroborar la participación de G en el proceso de maduración, se expresaron diferentes subunidades G, con el objeto de secuestrar G e inducir maduración. Se observó que Go induce el proceso de maduración, indicando que es un fuerte secuestrador de G. También se investigó el mecanismo por el cual progesterona podría estar afectando el intercambio GDP/GTP por parte de la proteína Gs. No se observó ningún efecto del esteroide sobre la capacidad de Gs de intercambiar nucleótido, incluso en un sistema activado por el ligando isoproterenol, indicando que progesterona no afecta directamente la función GEF del complejo hormona-receptor. Al respecto, se clonó desde ovocitos el cADN codificante para una xx proteína denominada sinembrina (xSin) y que posee actividad GEF. Se observó que la microinyección del ARNm para xSin bloqueó la maduración y su depleción por el uso de siARN aceleró el proceso, indicando la participación de esta proteína en la maduración meiótica. Basados en los resultados obtenidos en esta tesis se propone que Gs y G estarían participando en la mantención del estado inmaduro del ovocito, activando la AC y elevando los niveles de cAMP. Nosotros proponemos que el activador endógeno de Gs sería la proteína sinembrina, a través de su actividad GEF. Progesterona, a través de un mecanismo aún desconocido, interferiría con la función de sinembrina con la consecuente caída en los niveles de cAMP y maduración del ovocito.