Regulación transcripcional del gen DHN2 en Eucalyptus Nitens en respuesta a la aclimatación al frío.

Abstract

Las plantas de la especie E. nitens aumentan su tolerancia al congelamiento luego de ser expuestas a temperaturas frías no congelantes junto con una disminución de la longitud del día, en un fenómeno conocido como aclimatación a baja temperatura o endurecimiento. La acumulación de proteínas Dehidrinas (DHNs) se ha descrito como clave en este proceso, dado su rol de protección ante la disminución en el contenido de agua. El carácter inducible de estas proteínas ha sido foco de atención, dirigiendo el interés en la regulación transcripcional del gen y los genes que participan en su regulación. El objetivo del presente trabajo fue identificar TFs con elementos de unión a secuencias del promotor putativo del gen Eni.dhn2 y que sean relevantes en la inducción temprana del gen en respuesta a la aclimatación al frío. Para el estudio, plantas de una familia de medios hermanos de E. nitens caracterizada como tolerante al frío fueron expuestas a tratamientos de aclimatación. Inicialmente, las plantas se mantuvieron en una condición no aclimatada (NA) que luego de 7 días se cambió al tratamiento de aclimatación con temperatura y fotoperiodo de 8/4 °C y 10/14h, respectivamente. Se tomaron muestras justo después de disminuida la temperatura nocturna (15, 30 y 60 minutos de exposición), luego de 7 días (CABF) y luego de aplicadas 3 heladas nocturnas de -2°C (CAAF). Finalmente, la temperatura y el fotoperiodo se cambiaron a una condición de desaclimatación (DA 12/8 °C 14/10h), en la cual se evaluó la supervivencia de las plantas. Por otro lado se analizó la secuencia disponible del promotor putativo del gen Eni.dhn2 (776pb) en busca de elementos cis, utilizando la información contenida en la base de datos PlantCare. En base a los elementos cis encontrados y data correspondiente a genes diferencialmente expresados obtenidos de bibliotecas de RNA-seq de diferentes tratamientos de aclimatación, se seleccionaron TFs candidatos. A partir de hojas congeladas colectadas en cada punto del perfil de aclimatación se extrajo ARN y se determinó la expresión relativa de los genes codificantes para estos factores candidatos mediante la técnica de RT-qPCR. Utilizando el mismo material vegetal, se prepararon extractos nucleares y se realizaron ensayos de unión mediante EMSA para detectar complejos proteína-ADN diferencial en relación a los tratamientos de aclimatación. Para esto se generaron sondas conteniendo un elemento HSE del promotor del gen Eni.dhn2 (HSE1) o el elemento consenso HSE (HSEC), entre otras sondas. Los resultados obtenidos, en el ensayo de supervivencia y determinación de TL50, confirmaron la capacidad de responder al tratamiento de aclimatación simulado en condiciones de laboratorio. La expresión relativa de los genes candidatos Eni.hsfa2, Eni.rd26, Eni.myb4 y Eni.HB7 varió significativamente entre los tratamientos. Se determinó que el promotor putativo del gen Eni.dhn2 presenta un TSS y la TATA-box entre las posiciones -31 a -23 pb (relativo al TSS). La búsqueda en PlantCare permitió la identificación de elementos cis en el promotor del gen Eni.dhn2 relacionados a respuesta estrés o estímulos abióticos, como ABRE, G-box, ACE, HSE y circadian. La expresión relativa del gen Eni.hsfa2 aumentó significativamente al comparar los tratamientos NA-CABF y alcanzó el mayor nivel en la condición CAAF. Los resultados observados en los ensayos de unión mostraron que el elementos HSE presente en el gen Eni.dhn2 interacciona con una proteína presente en el extracto nuclear formando complejos de interacción proteína-ADN diferenciales al comparar extractos nucleares de diferentes condiciones. Se determinó que esta interacción es específica para dicho elementos, mediante ensayos de competencia. En su conjunto, las aproximaciones experimentales utilizadas en esta tesis exponen un posible rol en la respuesta al frío de la secuencia del elemento HSE encontrada en el promotor del gen Eni.dhn2.