Estudios de la participación de XtRic-8 durante el desarrollo neural de X. tropicalis.

Abstract

Ric-8 es una proteína citoplasmática de 63kDa conservada en vertebrados e invertebrados, la cual posee actividad GEF. Se ha descrito inicialmente que la función de Ric-8 en el sistema nervioso estaría estrechamente asociada con la señalización de las proteínas G, durante la liberación de vesículas sinápticas en C. elegans. También se ha demostrado que participa durante la división celular asimétrica, tanto en C. elegans como neuroblastos de Drosophila, lo que permite la diferenciación celular durante la embriogénesis. Estudios realizados en ratón demuestran que Ric-8A se expresa de manera neuroespecífica a lo largo del desarrollo. Además, se ha descrito que ratones mutantes heterocigotos para Ric-8 presentan problemas de ansiedad, en la memoria espacial y problemas de aprendizaje, mientras que ratones knockout para Ric-8 no son viables. Por otro lado recientemente hemos descrito el patrón de expresión de Ric-8 durante el desarrollo de Xenopus tropicalis el que muestra una expresión a nivel neural y derivados de crestas neurales. Sin embargo, el mecanismo de cómo Ric-8 estaría participando durante la neurogénesis aún no ha sido dilucidado. Con el fin de aportar a esta pregunta y debido a la importancia que puede tener Ric-8 en el desarrollo neural de vertebrados, se ha propuesto como hipótesis para esta tesis que: “Ric-8 participa en distintos contextos biológicos durante la embriogénesis, contribuyendo al correcto desarrollo neural en Xenopus tropicalis”. Para responder esta hipótesis se propone como objetivo general “Estudiar la participación de Ric-8 durante el desarrollo neural en X. tropicalis”. Primero, se analizó el patrón espacio-temporal de expresión de XtRic-8 durante el desarrollo embrionario de X. tropicalis, a través de la técnica de hibridación in situ, resultados que validan lospreviamente obtenidos en nuestro laboratorio, demostrando que la expresión de XtRic-8 es neuroespecífica, almenos en estadios tempranos de organogénesis. Luego con el fin de comenzar a realizar estudios funcionales segeneró un sistema de expresión inducible in vivo, a través de una técnica de transgénesis mediada por la meganucleasa I-Sce-I, donde se expresó al gen reportero GFP bajo la regulación del promotor inducible por calor (pXthsp70). Por otro lado, se generó un shRNA para silenciar XtRic-8, el cual se validó en un sistema celular en cultivo y también in vivo en el modelo Xenopus tropicalis. Luego se estudió el silenciamiento de XtRic-8, analizando el fenotipo obtenido a diferentes dosis de la construcción inducible y el efecto producido sobre marcadores neurales, tales como N-tubulina y Sox-2 a través de la técnica de hibridación in-situ. Fue posible observar que la pérdida de función de XtRic-8 produce un retardo en el desarrollo en comparación a los controles, generando un fenotipo celular de mayor tamaño. Así también se observó un desorden y/o pérdida del patrón de expresión de N-tubulina, y un aumento considerable del tamaño del lado microinyectado con el shRNA en relación a su lado control en neurulas de X. tropicalis. En estadios más tardíos, se observó una pérdida de movilidad y retardo en respuesta al tacto, siendo ésta mucho menor y más lenta que los controles. Estos resultados demuestran la participación de XtRic-8 durante el desarrollo neural y abren otras interrogantes del cómo está participando en este proceso.