Resumen:
El arsénico es un metaloide altamente tóxico especialmente en estado inorgánico
como arsenito [As (III)] y arseniato [As (V)]. Se encuentra ampliamente distribuido
en numerosos ambientes, en algunos de ellos puede alcanzar concentraciones
peligrosas para los humanos, produciendo diversas afecciones a la salud como
problemas vasculares en la piel hasta el desarrollo de cáncer.
Numerosos estudios muestran que existen bacterias, que cumplen un rol
fundamental en el ciclo biogeoquímico del metaloide, cambiando los estados de
oxidación, como por ejemplo, transformándolo desde un estado tóxico de arsenito
a un estado menos tóxico de arseniato.
Dichos microorganismos, presentan diversos mecanismos de resistencia para
contrarrestar la toxicidad del metaloide. Los principales mecanismos de
resistencia bacteriana se encuentran asociados a determinantes genéticos, los
que otorgan la capacidad de realizar dichas transformaciones del metaloide.
La facultad para oxidar el arsénico se debe fundamentalmente a la presencia de
una enzima, arsenito-oxidasa, la cual oxida As (III) a As (V). Se ha informado que
en bacterias heterotróficas la enzima se ubica a nivel del periplasma bacteriano, y
en bacterias quimiolitoautotróficas se encuentra en la membrana citoplasmática
asociada a la cadena transportadora de electrones.
Ésta enzima, es un heterodímero que consta de una subunidad catalítica mayor,
que contiene un centro de molibdeno y un centro HiPIP [3Fe-4S] y una subunidad
menor, formada por un centro Rieske [2Fe-2S]. Los genes que codifican para la
subunidad menor y mayor de la enzima son los asoBA, aroBA y aoxAB,
respectivamente. Estos genes se han detectado en una amplia gama de bacterias
y Archae, no obstante, no se habian descrito genes involucrados en la oxidación
de arsenito en el género Pseudomonas, pero recientemente dos Pseudomonas se
informo la presencia del gen.
El objetivo del presente trabajo fue caracterizar el gen de la enzima arsenitooxidasa
de Pseudomonas FN-41, bacteria arsenito-oxidante, aislada de
sedimentos del río Camarones, XV región Chile.
Se estudió la ubicación celular de la enzima arsenito oxidasa, mediante la
2
formación de esferoplastos, ultracentrifugación y ruptura celular por prensa
French.
Se investigó la presencia del gen arsenito oxidasa de la cepa en estudio mediante
PCR utilizando partidores degenerados (69F y 1374R). El producto de PCR
obtenido fue clonado y secuenciado. Posteriormente se realizaron análisis
comparativos con secuencias descritas para los genes asoA, aroA y aoxB
mediante Blast y ClustalW, determinando la similitud de aminoácidos, análisis
filogenéticos y análisis evolutivos.
Los resultados muestran que la arsenito oxidasa de Pseudomonas FN-41 tiene
ubicación periplasmática. Un 74.8 % de actividad enzimática respecto a la
actividad total, fue encontrada en la fracción periplasmática (0.158 μmoles de
DCIP/mgproteína/min). Mediante ultra-centrifugación, la región soluble
correspondiente al contenido periplásmico, presentó una mayor actividad
enzimática, alcanzando un 87.1% (0.203 μmoles de DCIP/mg proteína/min),
respecto a la actividad total. Mediante PCR, se obtuvo un producto de 1200 pb
aproximadamente, los que corresponden a la amplificación de la primera mitad de
la subunidad mayor de la arsenito oxidasa.
El alineamiento de las secuencia aminoacidica de la cepa en estudio con otras
secuencias de arsenito oxidasas, permitió determinar los aminoácidos implicados
en el sitio de unión del sustrato de la enzima, los cuales corresponden a los
residuos H195 y E203. Se identificaron los residuos S98 y A199, que pertenecen
a la subunidad catalítica de la enzima. También se identificó el motivo
HNRPAYNSE que es altamente conservado en bacterias arsenito oxidante.
Los análisis de similitud aminoacídica de la secuencia en estudio respecto al gen
aoxB de Cenibacterium arsenoxidans reveló ser un 45.1%, con el gen asoA de
Alcaligenes feacalis un 49.6% y con el gen aroA de Rhizobium sp. NT-26 un
45.1%. Estos resultados permiten concluir que en Pseudomonas. sp. FN-41 se
encuentra una arsenito oxidasa que se ubica en el espacio periplásmico. Presenta
el gen que codifica para la arsenito oxidasa y probablemente es distinto a los ya descritos.