Efecto de nanopartículas de cobre sobre la transferencia de genes involucrados en la metabolización bacteriana de plaguicidas.

Abstract

Los plaguicidas son sustancias químicas utilizadas ampliamente para controlar plagas en la agricultura. La mayoría de estos compuestos presentan efectos tóxicos para el ser humano y otras especies. Su remoción del ambiente es principalmente realizada por bacterias que presentan plásmidos catabólicos conjugativos, los cuales pueden ser diseminados en la comunidad microbiana mediante conjugación. Este proceso permite la transferencia horizontal de genes mediante el contacto directo entre una célula dadora y una célula receptora. Debido a su amplio espectro de acción antimicrobiano, se ha propuesto el uso de nanopartículas metálicas con fines agrícolas. Entre estas, las nanopartículas de cobre (CuNPs) presentan un amplio espectro de acción antibacteriana y menor costo de producción comparado a las de oro o plata. El mecanismo de acción de las CuNPs aún no está completamente definido, pero se ha reportado que presentan acción directa sobre la envoltura de las bacterias e indirecta a causa de la producción de especies reactivas de oxígeno que afectan proteínas, lípidos y ácidos nucleicos. Sin embargo, hasta la fecha existe muy poca información sobre los efectos de las CuNPs sobre la conjugación, proceso que puede ser afectado por diversos factores como cambios en parámetros físico-químicos o presencia de compuestos tóxicos. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue establecer el efecto del cobre a la forma de nanopartículas metálicas y de sulfato de cobre sobre la transferencia por conjugación de plásmidos catabólicos. En este estudio se realizaron ensayos de conjugación entre las cepas dadoras Cupriavidus pinatubonensis JMP134 (pJP4) y Pseudomonas sp. ADP (pADP-1) hacía las cepas receptoras Pseudomonas putida KT2440 y Pseudomonas sp. RG8. El plásmido pJP4 permite la degradación del plaguicida ácido 2,4 diclorofenoxiacético (2,4-D) y el plásmido pADP-1 permite la degradación del plaguicida atrazina. Las CuNPs (40-60 nm) fueron caracterizadas mediante microscopía electrónica, dispersión dinámica de la luz, difracción de rayos X y absorbancia atómica. Se evaluó su efecto sobre la viabilidad de las cepas en estudio y se realizaron ensayos de conjugación en medio líquido durante 6 h en presencia de CuNPs en concentraciones subhinibitorias y un control con una sal de cobre 13 (CuSO4). Las cepas transconjugantes se seleccionaron en placas con agar LB suplementado con agentes selectivos. En todas las cepas bacterianas se detectó su capacidad para degradar los plaguicidas y la presencia de genes degradativos mediante PCR. Los resultados indicaron que en caldo LB la disolución de las CuNPs es más rápida que en medio mineral. Además, la presencia de CuNPs y CuSO4 redujo la transferencia por conjugación de los plásmidos catabólicos pADP-1 y pJP4. Esto indicaría que el efecto negativo observado sobre la conjugación sería causado por la acción de los iones del metal más que un efecto de las nanopartículas. Por lo tanto, las CuNPs reducirían la capacidad de diseminación de los genes degradativos dependiendo de la capacidad de liberación de iones hacía el ambiente. Posteriormente se realizaron ensayos de conjugación entre la cepa dadora C.pinatubonensis AEO106 portadora del plásmido pRO101 y la cepa receptora P. putida KT2440 en presencia de CuSO4 y H2O2. El plásmido pRO101 es un derivado del pJP4 con la misma propiedad para degradar 2,4-D y un inserto genético que otorga resistencia a tetraciclina. Además, se determinó la expresión del gen traK, uno de los genes responsables del procesamiento del ADN plasmidial al comienzo de la conjugación, en presencia de distintas concentraciones de CuSO4. No se observó una reducción en la transferencia por conjugación en presencia de concentraciones subhinibitorias de CuSO4 o H2O2. Asimismo, se observó que la transferencia de dicho plásmido catabólico pRO101 ocurre en menos de 5 min, lo cual no ha sido descrito para plásmidos de la familia IncP, y que la expresión del gen traK en presencia de CuSO4 fue similar a su expresión en el control. Por lo tanto, debido a que la diseminación de plásmidos catabólicos por conjugación es fundamental en la remoción de plaguicidas desde el ambiente, este trabajo contribuye al conocimiento respecto de los efectos del cobre en el potencial biodegradativo de las comunidades microbianas.