Desarrollo y caracterización de un inhibidor biológico de factor de necrosis tumoral alfa capaz de mediar transcitosis en modelo in vitro de barrera hematoencefálica.

Abstract

Los inhibidores del factor de necrosis tumoral alfa (TNF⍺) podrían prevenir los trastornos neurológicos, pero su diseño generalmente se basa en moléculas incapaces de atravesar la barrera hematoencefálica (BHE). El objetivo de esta investigación fue diseñar y caracterizar un nuevo inhibidor del TNF⍺ compuesto por tres dominios: el angiopéptido-2 como molécula lanzadera de la BHE, el dominio extracelular del receptor 2 del TNF⍺ humano para bloquear al TNF⍺ y un dominio de dimerización del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) con mutaciones para eliminar su actividad angiogénica. Esta nueva proteína quimérica (MTV) podría desencadenar la transcitosis a través de la BHE mediada por la proteína relacionada con el receptor de lipoproteína de baja densidad 1 (LRP1) e inhibir el efecto citotóxico del TNF⍺ con mayor eficacia debido a su estructura dimérica. La transformación estable de células CHO permitió la expresión de la MTV, que luego se purificó mediante cromatografía de afinidad a iones metálicos con un alto nivel de pureza. Las mutaciones realizadas al dominio VEGF de MTV evitaron las actividades de proliferación celular y angiogénica analizadas por ensayos de cierre de herida en células ECV304 y generación de vasos en anillos aórticos, respectivamente. Las interacciones entre las moléculas MTV-TNF⍺ y MTV-LRP1 mostraron alta afinidad por termoforesis a microescala, y se observó un aumento significativo de la supervivencia celular tras bloquear el TNF⍺ con MTV en un ensayo de citotoxicidad celular. La unión y posible internalización de MTV en células endoteliales bEnd3 se demostró mediante inmunocitoquímica. Adicionalmente, se identificaron anticuerpos de dominio único (dAbs) afines a LRP1 mediante exposición antigénica en la superficie de fagos filamentosos (phage display). La transcitosis de estos fragmentos de anticuerpos a través de la BHE se demostró en modelo in vitro de BHE. Este estudio evidenció el funcionamiento de los tres dominios que componen la MTV, estableciéndola como candidato potencial para el tratamiento sistémico de los trastornos neurológicos. La identificación de dAbs que atraviesan la BHE constituye un hallazgo significativo, debido a que pudiesen sustituir al angiopeptido-2 en la molécula MTV o pudiesen utilizarse para conjugarlos a otros agentes terapéuticos para su acción en el sistema nervioso central.