Rodríguez Álvarez, LlerethyMelo Báez, Bárbara Belén2025-06-262025-06-262023https://repositorio.udec.cl/handle/11594/12763Tesis presentada para optar al grado de Doctora en Ciencias VeterinariasLas vesículas extracelulares (EVs) son secretadas por diferentes tipos celulares y cargan con diferentes moléculas como ARNm, pequeños ARNs, proteínas, lípidos, e incluso ADN, por lo que se ha propuesto utilizarlas como biomarcadores y agentes terapeúticos. Además, se han descrito como mecanismo de comunicación celular debido a su habilidad de transferir aquellas moléculas a células receptoras. Las EVs están involucradas en diversos procesos fisiológicos reproductivos como desarrollo de gametos y comunicación embrio-materna, incluso previo a la señalización molecular del reconocimiento de la gestación mediado por IFN-tau. Las características de las EVs como concentración, tamaño, distribución y contenido podrían reflejar la calidad embrionaria, y ser útiles para la predicción de la competencia embrionaria en embriones producidos in vitro. Este estudio tuvo como objetivo caracterizar las EVs secretadas por embriones bovinos producidos in vitro con diferente competencia embrionaria durante la activación del genoma embrionario, y la búsqueda de miRNAs asociados a EVs que permitan la selección temprana de embriones bovinos, además de identificar si estos miRNAs reflejan el estado molecular del embrión. En el primer experimento se colectaron las EVs producidas por embriones cultivados individualmente desde la activación del genoma embrionario (día 3.5 post-IVF) hasta la compactación embrionaria (día 5 post-IVF), y se clasificaron según la capacidad de alcanzar el estadío de blastocisto al día 7. Las EVs expresaron marcadores específicos de superficie como CD9, CD81, CD63 y CD40 en ambos grupos experimentales, y presentaron redondeada con bicapa lipídica. Los embriones que se bloquearon al día 3.5 post-IVF (G1) secretaron mayor concentración de EVs, y éstas tenían un tamaño superior, en comparación a las EVs secretadas por embriones que continuaron su desarrollo (G2). Se identificaron 95 miRNAs en las muestras y 8 miRNAs se expresaron diferencialmente entre los grupos experimentales (G1 contra G2), donde bta-miR-103, bta-miR-100, bra-miR-502a y bta-miR-1 se encontraron sobreexpresados en las EVs secretadas por embriones bloqueados (G1), mientras que bta-miR-92a, bta-miR-140, bta-miR-2285av y bta-miR-222 se encontraron sobreexpresados en el G2. Aquellos miRNAs sobre expresados se encuentran regulando vías de señalización importantes para el desarrollo embrionario como biosíntesis y metabolismo de ácidos grasos, degradación de lisina, gap junction y regulación de células madre. En el segundo experimento, se realizó biopsia en embriones bovinos de 8 células al día 3.5 post-IVF y se mantuvo en cultivo individual en medio depletado de EVs hasta el día 5. Se evaluó el set de miRNAs en las blastómeras colectadas al día 3,5 post-IVF, en el embrión resultante al día 5 post-IVF y en el medio de cultivo condicionado durante esta etapa de desarrollo. Se encontró mayor expresión de bta-miR-100, bta-miR-92a, bta-miR-222 en las blastómeras obtenidas mediante biopsia de embriones al día 3.5 post-IVF en relación con los embriones al día 5 (p<0.05). La expresión de bta-miR-100 y bta-miR-103 es mayor en los embriones bloqueados que los embriones competentes. Además, en el caso de bta-miR-100 y bta-miR-103 se sigue un patrón de expresión génica decendiente desde las blastómeras, hacia los embriones, tanto en los bloqueados como en los competentes (p<0.05). Con respecto a bta-miR-140, la mayor expresión se obtuvo en las EVs de los embriones que se bloquearon (p<0.05). En conclusión, los embriones secretan EVs, cuyas características morfológicas y moleculares dependen de su competencia y estadío de desarrollo. Al mismo tiempo, el embrión utiliza la secreción de EVs como un método de descarte de moléculas perjudiciales para intentar rescatar el desarrollo embrionario.Extracellular vesicles (EVs) are secreted by different cellular types and carry several molecules such as mRNA, small RNAs, proteins, lipids, and DNA. Because of that, they have been proposed as biomarkers and potential therapeutic agents. In addition, they have been described as a cellular communication mechanism due to their ability to transfer those molecules to recipient cells. EVs are involved in diverse reproductive physiological processes including gamete development and embryo-maternal interaction, even before the onset of molecular signaling of pregnancy recognition mediated by IFN-tau. The characteristics of EVs, including their concentration, size, distribution, and content, might reflect embryo quality, thus making them potential markers of developmental competence in embryos produced in vitro. This study aimed to characterize EVs secreted by in vitro-produced bovine embryos with different embryonic competence during embryonic genome activation, identification of miRNAs within EVs that could allow an early selection of embryos, and define if the miRNA content in EVs reflects the molecular content of the embryo. In the first experiment, EVs produced by individually cultured embryos were collected from the moment of the embryonic genome activation (day 3.5 post-IVF) until compaction (day 5 post-IVF), and they were classified according to the ability to reach blastocyst stage at day 7. Collected EVs expressed specific surface markers such as CD9, CD81, CD63 and CD40 in both experimental groups, and presented rounded shape with lipid bilayer. Embryos that were blocked at day 3.5 post-IVF (G1) secreted a higher concentration of EVs, and these were larger in size, compared to the EVs secreted by embryos that continued their development (G2). 95 miRNAs were identified among the samples, and 8 were differentially expressed between experimental groups (G1 versus G2), where bta-miR-103, bta-miR-100, bra-miR-502a and bta-miR-1 were found upregulated in EVs secreted by blocked embryos (G1), while bta-miR-92a, bta-miR-140, bta-miR-2285av and bta-miR-222 were found upregulated in G2. Those upregulated miRNAs are found to regulate important signaling pathways for embryonic development such as fatty acid biosynthesis and metabolism, lysine degradation, gap junctions, and stem cell regulation. In the second experiment, biopsies were performed on 8-cell bovine embryos at day 3.5 post-IVF and they were maintained in individual culture in EVs-depleted media until day 5. The set of miRNAs was evaluated in the blastomeres collected at day 3.5 post-IVF, in the resulting embryo at day 5 post-IVF and in the conditioned culture media during this window of development. Higher expression of bta-miR-100, bta-miR-92a, bta-miR-222 was found in the blastomeres obtained by biopsy of embryos at day 3.5 post-IVF in relation to embryos at day 5 (p<0.05). The expression of bta-miR-100 and bta-miR-103 is higher in blocked embryos than competent embryos. Furthermore, in the case of bta-miR-100 and bta-miR-103, a descending gene expression pattern is followed from the blastomeres to the embryos, both in the blocked and in the competent ones (p<0.05). Regarding bta-miR-140, the highest expression was obtained in the EVs of the embryos that were blocked (p<0.05). In conclusion, embryos secrete EVs, whose morphological and molecular characteristics depend on their competence and stage of development. At the same time, the embryo uses the secretion of EVs as a method of discarding harmful molecules to try to rescue embryonic development.esCC BY-NC-ND 4.0 DEED Attribution-NonCommercial-NoDerivs 4.0 InternationalDesarrollo embrionarioVesículas extracelularesOvinosThesis