Arquitectura regulatoria osteogénica del locus SCPP

Abstract

La familia del locus SCPP (Secretory Calcium-binding PhosphoProtein) codifica para componentes esenciales de matriz del tejido esquelético mineralizado en vertebrados. En el anfibio Xenopus tropicalis, el locus abarca 150 Kb y contiene los genes Dmp1, Ibsp y Scppa2 que se expresan en hueso. Estos genes se originaron desde un ancestro común por duplicaciones en tándem. Durante el proceso evolutivo, cada uno de estos genes ha generado patrones de expresión divergentes. Dmp1 se expresa en osteocitos mientras que Ibsp y Scppa2 se expresan en osteoblastos y osteocitos. El objetivo de este trabajo fue entender cómo los miembros del locus SCPP son regulados y por lo tanto pueden desplegar patrones de expresión divergentes. Se propone que dicha regulación involucra la acción de múltiples MCRs que contactan y coregulan promotores de miembros coexpresados en etapas específicas del proceso de diferenciación del linaje osteogénico. El primer objetivo consistió en combinar hibridación in situ con tinción nuclear con DAPI usando pruebas exónicas (transcritos citoplasmáticos estables) e intrónicas (transcritos nucleares transcientes) y se demostró que Ibsp es un gen que se expresa activa y exclusivamente en osteoblastos y no en osteocitos. Los datos derivados de este trabajo revelaron un fuerte cambio regulatorio en la transición osteoblasto-osteocito. Ibsp es abruptamente apagado mientras Dmp1 es rápidamente activado. En todos los experimentos se incluyó también el gen Sparc debido a que comparte una historia evolutiva con el gen Sparcl1, del cual derivaron los SCPP por duplicaciones en tándem y su expresión en hueso es similar a la del gen Ibsp. Considerando que osteocitos directamente diferencian desde osteoblastos, la expresión osteocítica reportada previamente para Ibsp y Sparc se debe a la vida media larga de los RNA mensajeros y no a un proceso activo de transcripción. Usando el enriquecimiento de marcas de cromatina asociadas a enhancers activos, se caracterizó la actividad transcripcional en osteoblastos de los MCRs putativos activos y ligados al locus SCPP y los MCRs ligados a Sparc. Se identificaron 2 enhancers que activan el promotor de Ibsp, uno proximal (fuerte) y uno distal (débil). Sorpresivamente, el promotor de Scppa2 fue reprimido por dos MCRs, uno de ellos ligeramente activó el promotor de Ibsp. Ningún enhancer putativo activó el promotor de Dmp1, lo que era esperado dado que dicho promotor no es activo en osteoblastos. Respecto a Sparc, al menos 3 enhancers fueron activos, dos proximales (fuertes) y un distal (débil). Para evaluar si la arquitectura de la cromatina está involucrada en mantener unidos los miembros SCPP se utilizó el ensayo de Captura de Conformación de Cromosoma Circular (4C seq) en osteoblastos primarios. Se identificaron las interacciones entre los promotores basales de los genes SCPP con diferentes regiones del genoma. También se demostraron las diferentes interacciones asociadas al promotor Sparc. Se demostró que los genes SCPP ácidos expresados en hueso se encuentran en un microdominio de interacciones frecuentes. El enhancer proximal que activó Ibsp tuvo una alta frecuencia de interacción con su promotor blanco. Se demostró también que los promotores Ibsp y Dmp1 se contactan. Respecto a Sparc, los enhancers proximales de mayor actividad en estudios reporteros contactan a su promotor, el enhancer proximal además muestra cromatina abierta y es conservado en la evolución de vertebrados. Los resultados de este trabajo permitieron entender cómo los miembros del locus SCPP se han mantenido en clúster, y cómo han adquirido expresión diferencial en el linaje osteogénico contribuyendo así al entendimiento de los mecanismos transcripcionales desplegados durante la transición osteoblasto/osteocito.