Identificación del gen CEBPα en pacientes con leucemia mieloide aguda y su potencial uso clínico.

Abstract

La leucemia mieloblástica aguda (LMA) se produce por acumulación de mutaciones en células pluripotentes hematopoyéticas, provocando un bloqueo en la diferenciación, apoptosis y un aumento en la proliferación. Entre sus alteraciones moleculares se registran mutaciones puntuales en el gen CEBPα doble mutación, estas ultimas se asocia con un pronóstico favorable de sobrevida global y sobrevida libre de eventos teniendo una mejor respuesta al tratamiento, en comparación con pacientes sin mutaciones en CEBPα. El estudio molecular del gen CEBPα en adultos se menciona en la guía clínica del paciente leucémico del ministerio de salud, sin embargo, no se estudia en este grupo etario, ni tampoco en pacientes pediátricos debido a que no se encuentra disponible en ningún laboratorio clínico público de biología molecular. La técnica de reacción en cadena de la polimeraza (PCR) para amplificar el gen CEBPα no se ha estandarizado en los laboratorios antes señalados, debido a que la región codificante del gen presenta un alto contenido de guanina (G) citocina (C) (>65%), y una secuencia de repetición de trinucleótidos, lo que dificulta su amplificación. Para obtener la secuencia amplificada del gen CEBPα se requiere comparar y elegir una técnica de extracción de ADN (Columna, Columna más Perlas y Sales) y estandarizar la PCR por las características del gen, sugiriendo el uso de PCR gradiente con DMSO. El desarrollo de un protocolo de amplificación y secuenciación permite caracterizar el gen CEBPα en pacientes con LMA. Desarrollar de un protocolo de amplificación y secuenciación del gen CEBPα para el estudio molecular de pacientes con Leucemia Mieloide Aguda. Se realizó un estudio observacional de cohorte transversal, con muestreo no probabilístico por conveniencia para una muestra de 3 personas voluntarias sin LMA durante el I semestre de 2021. Luego se realiza la extracción de ADN de 10 pacientes con LMA desde muestras de matriz sangre periférica y médula ósea. Se evalúan las técnicas de extracción en cuanto a concentración y pureza del ADN, costos y tiempo. Luego se realizó PCR para amplificar el gen CEBPα desde el ADN de los pacientes sanos y con LMA considerando partidores publicados, y otros de elaboración propia, se evalúo el protocolo de amplificación, ajustando temperaturas de alineamiento y adyuvantes, como DMSO en distintas concentraciones. Se realizó electroforesis en gel de agarosa para evaluar integridad del ADN extraído y también del ADN amplificado. Luego se secuencian las regiones amplificadas por método de sanger, llegando a establecer el protocolo completo del estudio del gen CEBPα. La técnica de extracción por sales en muestras de concentrado de leucocitos fue la más óptima en cuanto a rendimiento, al observarse diferencias estadísticamente significativas (p<0,005) en cuanto a concentración de ADN con respecto a la técnica de columna. La estandarización de la PCR y la amplificación de la región codificante del gen CEBPα completa con un solo juego de partidores, y por fragmentos con dos juegos de partidores, se logró con todos los pares de partidores estudiados a una temperatura de alineamiento de 62 y 64°C, siendo posible mediante el uso de DMSO a un 3 y 8% obteniendo bandas únicas en gel de agarosa. La secuenciación utilizada fue tipo sanger, la que mostró que, en el caso de la región amino terminal, hubo un producto secuenciado optimo con la elaboración de una secuencia consenso. La estandarización de la técnica de extracción de ADN, PCR y secuenciación para el estudio del gen CEBPα permitirá obtener información útil en el diagnóstico de pacientes con LMA otorgándole al clínico mejores herramientas para decidir una adecuada terapia en este contexto.

Acute myeloblastic leukemia (AML) arises from the accumulation of mutations in hematopoietic stem cells, resulting in a disruption of cell differentiation, apoptosis, and increased proliferation. One of the notable molecular alterations involves point mutations in the CEBPα gene, which have been associated with a favorable prognosis in terms of overall survival and event-free survival. Patients with CEBPα mutations tend to exhibit better treatment responses compared to those without these mutations. Although the clinical guide for leukemic patients issued by the Ministry of Health acknowledges the molecular study of the CEBPα gene in adults, it is currently unavailable for this age group as well as pediatric patients in any public clinical laboratory specializing in molecular biology. This limitation primarily stems from the absence of standardized polymerase chain reaction (PCR) techniques for amplifying the CEBPα gene. The gene's coding region presents a high guanine (G) and cytosine (C) base content (> 65%) and includes a trinucleotide repeat sequence, posing challenges in the amplification process. Successful amplification of the CEBPα gene necessitates a comparison and selection of DNA extraction techniques and the standardization of PCR conditions based on the gene's characteristics. Developing a comprehensive protocol encompassing amplification and sequencing will enable the characterization of the CEBPα gene in AML patients. An observational cross-sectional cohort study was conducted during the first semester of 2021. A non-probability convenience sampling method was employed, and an initial sample of three AML-free volunteers was included. Subsequently, DNA extraction was performed on peripheral blood and bone marrow samples from ten AML patients. The extraction techniques were evaluated based on DNA concentration, purity, cost, and time. PCR was then conducted to amplify the CEBPα gene in both healthy individuals and AML patients, using both published and newly designed primers. The amplification protocol underwent evaluation by adjusting annealing temperatures and incorporating adjuvants such as DMSO at varying concentrations. Agarose gel electrophoresis was utilized to assess the integrity and amplified DNA. Finally, the amplified regions were sequenced using the Sanger method, establishing a comprehensive protocol for studying the CEBPα gene. Among the evaluated extraction techniques, the salt extraction method employed on concentrated leukocyte samples demonstrated the most optimal performance. Significant statistical differences (p<0.005) in DNA concentration were observed compared to the column technique. PCR standardization successfully accomplished the amplification of the complete coding region of the CEBPα gene using a single set of primers, as well as fragment amplification using two sets of primers. The optimal annealing temperatures for all primer pairs were determined to be 62 and 64 °C, and the use of 3% and 8% DMSO facilitated the generation of single bands in agarose gel electrophoresis. The sequencing method employed was the Sanger method, which yielded optimally sequenced products for the amino terminal region, enabling the elaboration of a consensus sequence. Standardizing the DNA extraction, PCR, and sequencing techniques for studying the CEBPα gene will provide valuable diagnostic information for AML patients, equipping clinicians with improved tools to make informed decisions regarding appropriate therapy in this context.