Modulación del receptor alfa-3 de glicina por alopregnanolona.

Abstract

El receptor de glicina (RGli) es un canal iónico de tipo inhibitorio, miembro de la familia de canales iónicos pentaméricos activados por ligando (pLGICs). Los estudios electrofisiológicos y de comportamiento han demostrado la participación de la transmisión glicinérgica, mediada principalmente por RGli conteniendo la subunidad α3, en procesos de ansiedad, depresión y adicción a etanol. Dentro de estas regiones donde se expresa RGli, hormonas esteroidales como la Pregnenolona y alopregnanolona son sintetizadas, las cuales han sido ampliamente caracterizadas como moléculas que median procesos de ansiedad y depresión. De forma interesante, estudios electrofisiológicos han demostrado que la actividad de las subunidades α1 y α2 del RGli es modulada alostéricamente por el neuroesteroide Pregnenolona. En esta línea, aun cuando los datos experimentales que avalan el rol de la subunidad α3 del RGli en procesos de ansiedad y depresión han mostrado un aumento sostenido, no existen estudios funcionales que evalúen la modulación de RGli α3 por hormonas esteroidales que median estos procesos. En base a estos antecedentes, se propone que la función del RGli compuesto por la subunidad α3 es modulada por compuestos neuroestroidales como Alopregnanolona. Para esto, mediante técnicas de unión molecular proteína – ligando y dinámica molecular in silico, en conjunto con registros electrofisiológicos, se generaron complejos proteína-ligando entre la estructura RGli α3 no solamente con Alopregnanolona, sino también con Pregnenolona Sulfatada (PREG-S), Deshidroepiandrosterona (DHEA), Tetrahidrodeoxicorticosterona (THDOC) y Androstanediol (3α-Diol), con cálculos teóricos de energía libre (ΔG) favorables para su posible unión, y centrándose en la región transmembrana TM1 y TM3. Estos complejos fueron formados solo con la estructura del receptor en su estado abierto, no así en su conformación cerrada. Adicionalmente, los ensayos de dinámica molecular demuestran que esta interacción es estable permitiendo identificar sus residuos importantes como W243, A303, A302, F306 y W239. Los estudios de electrofisiología muestran una modulación alostérica positiva en la función de RGli α3 por Alopregnanolona, llegando a un máximo de potenciación del 30% aproximadamente. Para confirmar el sitio de unión para Alopregnanolona, mutamos los residuos de W239Q y A303T, observándose un cambio en la de-activación del canal. En conclusión, nuestros resultados demuestran que la función del receptor de glicina conformado por la subunidad α3 es potenciada por alopregnanolona, con residuos críticos para su unión como W243 y W239. Futuros experimentos en sistemas neuronales contribuirán a definir la participación de Alopregnanolona en las corrientes tónicas mediadas por RGli α3 nivel sináptico.

Glycine receptors are inhibitory ionic channels permeable to anions, which belong to the pentameric ligand-gated ion channels (pLGICs) superfamily. In this context, electrophysiological and behavioral studies have reported the participation of the glicinergic transmission, mediated mainly by the GlyR α3, in processes like anxiety, depression and ethanol addiction. In the same regions, steroidal hormones such as Pregnenolone and Allopregnanolone are synthesized, and have been characterized as molecules that mediated processes like anxiety and depression. Interestingly, electrophysiological recordings have demonstrated that the function of the GlyR composed by the α1 and α2 are modulated by the neurosteroid pregnenolone. However, although experimental data supporting the role of GlyR α3 in anxiety and depression is increasing, there are no experimental data that support the modulation of the GlyR α3 with neuroesteroidal hormones. Here, by using docking, molecular dynamics simulation and electrophysiological recordings, we examined the ability of a set of neurosteroids to bind and modulate the GlyR α3 function. Our results shows that, the protein-ligand complexes was formed between the receptor and allopregnanolone, pregnenolone sulfate (PREG-S), dehydroepiandrosterone (DHEA), tetrahydroepiandrosterone (THDOC) and 3α-androstanediol (3α Diol) with favorable theoretical free energy bind calculations, centered in the transmembrane domain TM1 and TM3. These complexes were only obtained with the receptor in its open conformation. Additionally, the molecular dynamic simulations shows that the ligand allopregnanolone stays in the predicted binding pocket, reporting critical amino acids like W243, A303, A302, F306 and W239.The electrophysiological studies report a positive modulation of the GlyR α3 by allopregnanolone, with a potentiation peak of 30%. In conclusion, our results report that the function of the GlyR composed by the α3 subunit is potentiated by allopregnanolone. For this modulation residues W239 and A303 play a critical role in accommodated the molecule in a putative binding pocket. Future experiments in neural systems will contribute to define the participation of the GlyR α3 and neurosteroids such as allopregnanolone in a physiological context.