Desarrollo y producción recombinante de un péptido bloqueador de TNF para el tratamiento de trastornos autoinmunes inflamatorios.

Abstract

El Factor de Necrosis Tumoral (TNF; de sus siglas en inglés, tumor necrosis factor), se ha transformado en una importante diana terapéutica para el tratamiento de trastornos autoinmunes inflamatorios. A la fecha, existen 5 biofármacos bloqueadores de TNF aprobados por la FDA que corresponden a proteínas de fusión y anticuerpos monoclonales. A pesar de los resultados terapéuticos informados, estos biofármacos poseen desventajas que limitan su uso, entre ellas: (i) deben ser producidos en cultivos de células de mamíferos, a un elevado costo de producción, (ii) son moléculas considerablemente grandes (~150 kDa), lo que limita la penetración de tejidos y condiciona el uso de altas dosis, (iii) tienen altos precios de mercado (~100 000 dólares/año, para una terapia individual), lo que implica que menos del 10% de los pacientes tenga acceso a este tipo de terapia. Para solucionar estas limitaciones, el Laboratorio de Biofármacos Recombinantes (LBR), de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad de Concepción, empleando la tecnología de Phage Display, ha desarrollado un péptido de unión a TNF (CBB288) con capacidad bloqueadora. Los péptidos, como potenciales bioactivos, suelen ser selectivos, poco tóxicos, y con un tamaño molecular (≤5 kDa) que permite el uso a bajas dosis respecto a los anticuerpos monoclonales. Como limitante, es conocido que existe una escasa optimización de operaciones a escala industrial para sintetizar péptidos, resultando la síntesis química de péptidos en un proceso caro y poco sustentable que genera un exceso de residuos tóxicos. En este marco, el avance de la biotecnología ofrece variantes con buena combinación de costo-sustentabilidad, donde sobresale la expresión de proteínas en Escherichia coli. En este trabajo, tres etapas fundamentales fueron establecidas para producir el r-CBB288, en una primera etapa de fermentación se expresaron copias repetidas del CBB288 en forma de tándem, luego, para obtener el péptido recombinante se realizó una proteólisis asistida con hidroxilamina (HX) y posteriormente para purificar el péptido se utilizó una cromatografía de exclusión molecular (CEM). Las tres operaciones se evaluaron mediante diseño experimental para analizar la influencia de los principales parámetros operacionales sobre las variables respuestas más importantes. En el caso de la CEM, resulta válido aclarar que las operaciones de purificación en los procesos biotecnológicos constituyen alrededor del 70% del costo total de producción, motivo por el cual estas operaciones deben ser optimizadas con rigor, para evitar afectaciones en la factibilidad del proceso. En este sentido, para la CEM se desarrolló un modelo fenomenológico que permite describir la operación e inferir el comportamiento a dimensiones requeridas. Para demostrar que el r-CBB288 conserva la capacidad unirse al TNF, ensayos de Termoforesis en Microescala (TMS) determinaron las constantes de disociación (Kd) respecto a la diana molecular. Además, ensayos MTT se llevaron a cabo para demostrar el bloqueo de la actividad citotóxica del TNF. Por otra parte, se demostró que la alternativa del péptido sintético no presenta diferencias respecto a su homólogo recombinante en cuanto a afinidad, para esto se realizó un estudio de simulación in silico desarrollado mediante dinámica molecular. Finalmente, un análisis técnico-económico del proceso se ejecutó mediante la herramienta de simulación computacional SuperPro Designer. Los resultados obtenidos sugieren que el péptido diseñado previamente CBB288 puede ser obtenido a partir de un proceso recombinante y utilizado en futuros estudios biomédicos relacionados con las patologías de inflamación crónicas.

Tumor Necrosis Factor has become an important therapeutic target for the treatment of inflammatory autoimmune disorders. To date, there are five FDA-approved TNF-blocking biopharmaceuticals that correspond to fusion proteins and monoclonal antibodies. Despite the reported therapeutic results, these biopharmaceuticals have drawbacks that limit their use and a high production cost in mammalian cells. In this study, we designed a recombinant TNF blocking peptide (CBB288). Our approach consisted in a recombinant tandem protein containing 15 copies of the peptide was obtained in E. coli. The tandem protein expression was induced using IPTG. The hydrolysis of the tandem protein to obtain monomeric units of the CBB288 peptide was performed using the hydroxylamine method. Recombinant peptide (r-CBB288) exhibited a high binding affinity to TNF with KD=2,39x10-5 ± 0,15 mol.L-1 , similarly to synthetic homologue peptide (syn-CBB288); KD=1,03x10-5 ± 0,05 mol.L-1 . The TNF-neutralizing activity of r CBB288 was assessed in L929 cells. r-CBB288 was able to inhibit TNF induced cytotoxicity in a dose response manner, resulting in a maximum viability recovery of 79%. According to an in silico simulation study, it was demonstrated that the differences between the synthetic and recombinant peptides do not modify the predicted binding affinity for the target protein. The results obtained suggest that CBB288 could be obtained by a recombinant process and used for future biomedical studies related to chronic inflammation pathologies.