Efecto de la vitamina C en células endoteliales microvasculares de cerebro humano en modelo de isquemia-reperfusión in vitro.

Abstract

Los Accidentes cerebrovasculares (ACV) son la segunda causa de muerte en Chile, donde el 60% de los casos es de tipo isquémico. En estos se genera una reducción de nutrientes y oxígeno en la zona afectada del cerebro, lo cual desencadena un desbalance redox con un aumento de los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) que generan daño y muerte celular. Dentro de las células afectadas están las células endoteliales (CE), las cuales son las encargadas proteger la integridad de la barrera hematoencefálica (BHE), por lo que su muerte facilita la destrucción y perdida de funcionalidad de la BHE. Para regular el desbalance redox existen los antioxidantes como la vitamina C (VitC), que está presente en el organismo en su forma oxidada (ácido dehidroascórbico; DHA) y reducida (ácido ascórbico; AA). Siendo el AA un potente reductor capaz de neutralizar radicales libres. Ambas formas de la VitC ingresan a la célula por distintos transportadores, los GLUTs por el DHA y los SVCTs por el AA. Existe evidencia de que los transportadores SVCT2 aumentan su expresión en procesos isquémicos en células de endotelio cerebral de ratón, pero esto aún no ha sido estudiado en células de endotelio cerebral humano. En el presente estudio implementamos un modelo in vitro de barrera hematoencefálica utilizando células endoteliales microvasculares de cerebro humano (HBMEC), que al diferenciarlas expresan proteínas de uniones estrechas (TJP) al igual que una BHE, evaluamos las TJP con la expresión de la proteína ZO-1 mediante inmunofluorescencia. Establecimos un modelo in vitro de isquemia y reperfusión (Isq-R), evaluando por MTT sus efectos sobre la viabilidad celular, por westernblot la expresión de HIF1-α y por inmunofluorescencia la disminución de la expresión de la proteina ZO-1. Evaluamos la expresión de los transportadores de VitC posterior a una Isq-R mediante RT-qPCR e inmunofluorescencia. Además, analizamos mediante citometria de flujo el aumento de los niveles de ROS posterior a la Isq-R y el efecto del tratamiento con VitC sobre estos niveles. Nuestros resultados muestran que el modelo de Isq-R in vitro es capaz de generar daño endotelial en nuestro modelo de BHE. Además, encontramos que posterior a una Isq-R hay una disminución en la expresión de los transportadores GLUT1 y SVCT2, mientras que SVCT1 aumenta su expresión. También, encontramos niveles de ROS elevados posterior a una Isq-R, los cuales disminuyen luego de 24 horas de reperfusión. Observamos una tendencia en la disminución de los niveles de ROS, donde el tratamiento con AA generó niveles menores de ROS con respecto a la condición sin tratamiento. Estos resultados permiten dilucidar el importante rol que cumplen los antioxidantes sobre el daño oxidativo, y en concreto la gran relevancia que toma la VitC junto a sus transportadores en la BHE bajo un estado de Isq-R, el cual se asemeja a la condición que se genera a nivel cerebral en un ACV. Destacamos el hallazgo del aumento de expresión del transportador SVCT1, el cual podría estar cumpliendo un rol crucial en este tipo de patologías. Aún faltan muchas aristas por estudiar, pero con los resultados obtenidos posiblemente estamos ante un futuro blanco terapéutico para disminuir el daño que se genera en el ACV y otras patologías que aún no posee un tratamiento efectivo.

Stroke is the second leading cause of death in Chile, where 60% of cases are ischemic. In these cases, a reduction of nutrients and oxygen occurs in the affected area of the brain, triggering a redox imbalance with an increase in reactive oxygen species (ROS) levels that generate cellular damage and death. Among the affected cells are endothelial cells (EC), which are responsible for protecting the integrity of the blood-brain barrier (BBB). Therefore, their death facilitates the destruction and loss of BBB functionality. Antioxidants such as vitamin C (VitC) are available to regulate the redox imbalance. VitC exists in the body in its oxidized form (dehydroascorbic acid; DHA) and reduced form (ascorbic acid; AA). AA is a potent reductant capable of neutralizing free radicals. Both forms of VitC enter the cell through different transporters: DHA enters through GLUTs, and AA through SVCTs. There is evidence that SVCT2 transporters increase their expression in ischemic processes in mouse cerebral endothelial cells, but this has not yet been studied in human cerebral endothelial cells. In this study, we implemented an in vitro model of the blood-brain barrier using human brain microvascular endothelial cells (HBMEC), which, upon differentiation, express BBB-like tight junction proteins (TJPs). We evaluated the TJPs through ZO-1 protein expression using immunofluorescence. We established an in vitro model of ischemia and reperfusion and evaluated its effects on cell viability through the MTT assay, the expression of HIF1-α through western blot, and the decrease in ZO-1 protein expression through immunofluorescence. Subsequently, we assessed the expression of VitC transporters after ischemia and reperfusion using RT-qPCR and immunofluorescence. Additionally, we analyzed the increased levels of ROS after ischemia and reperfusion and the effect of VitC treatment on these levels using flow cytometry. Our results demonstrate that the in vitro ischemia and reperfusion model is capable of generating endothelial damage in our BBB model. We also found a decrease in the expression of GLUT1 and SVCT2 transporters after ischemia and reperfusion, while SVCT1 showed increased expression. Furthermore, we observed elevated levels of ROS after ischemia and reperfusion, which decreased after 24 hours of reperfusion. There was a trend towards decreased ROS levels, and AA treatment generated lower ROS levels compared to the untreated condition. These results shed light on the important role of antioxidants in oxidative damage, particularly emphasizing the relevance of VitC and its transporters in the BBB under an ischemia and reperfusion state that resembles the conditions occurring in a stroke. We highlight the finding of increased SVCT1 transporter expression, which may play a crucial role in such pathologies. While there are still many aspects to be studied, the obtained results potentially open up therapeutic opportunities to mitigate the damage caused by stroke and other conditions that currently lack effective treatments.